缺血预处理对失血性休克大鼠血管反应性及钙敏感性的影响*

胡 弋, 李 涛, 徐 竞, 唐小唪, 刘良明△

(第三军医大学大坪医院1麻醉科，2野战外科研究所二室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042)

缺血预处理对失血性休克大鼠血管反应性及钙敏感性的影响*

胡 弋1,2, 李 涛2, 徐 竞2, 唐小唪1, 刘良明2△

(第三军医大学大坪医院1麻醉科，2野战外科研究所二室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042)

目的观察缺血预处理对失血性休克血管反应性和钙敏感性的影响。方法通过观察不同缺血预处理方法对失血性休克大鼠存活时间和24 h存活率的影响，选择最适缺血预处理方法。在体实验，观察缺血预处理对失血性休克大鼠肠系膜上动脉(SMA)血管管径对去甲肾上腺素 (NE)收缩反应性和NE升压反应的影响；离体实验，应用离体血管环张力测定技术，观察缺血预处理对失血性休克后大鼠SMA环血管反应性和钙敏感性的影响。结果确定最适缺血预处理方法为：夹闭腹主动脉1 min，开放5 min，重复3次，2 h后复制失血性休克模型，这种方法可显著增加失血性休克大鼠的存活时间和24 h存活率。在体实验，缺血预处理可显著增加休克晚期NE的升压效应和在体SMA对NE的收缩反应(P<0.01)。离体实验，与失血性休克对照组比较，缺血预处理组SMA在休克早期(休克即刻)对NE的收缩反应性和钙敏感性明显下降(P<0.05)，但与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)；在休克后期(休克2 h、3 h、4 h)，缺血预处理组SMA对NE的收缩反应性和钙敏感性显著增加(P<0.05)，且与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论缺血预处理可能通过改善血管钙敏感性发挥对休克后期血管反应性的保护效应。

缺血预处理； 休克，出血性； 血管反应性； 钙敏感性

材 料 和 方 法

1动物

清洁级SD大鼠112只，雌雄不拘，体重(218.0±25.6) g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。

2不同IPC方法对失血性休克大鼠存活率和24h存活时间的影响

40只大鼠随机分为失血性休克对照组、IPCⅠ、Ⅱ、Ⅲ组，每组大鼠均为10只。实验前12 h大鼠禁食、自由饮水，实验当天戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后, 经右侧股动、静脉插管,股动脉接水银血压计供放血和监测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)，股静脉供复苏。IPCⅠ、Ⅱ、Ⅲ组打开腹腔，分离肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA)分支处的腹主动脉，分别夹闭腹主动脉1 min，开放5 min；夹闭3 min，开放3 min；夹闭3 min，开放5 min，均重复3次；失血性休克对照组则仅分离SMA分支处的腹主动脉。4组大鼠均在上述处理2 h后经右侧股动脉导管放血，在10 min内将MAP降至40 mmHg，在此水平维持4 h后，将抽取的全血及等量乳酸林格氏液在30 min内回输入大鼠体内，记录大鼠24 h存活时间及存活率。

3IPC对失血性休克大鼠去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)升压效应及在体SMA对NE收缩反应性的影响

24只大鼠随机分为假手术组、失血性休克对照组和IPC组(根据上述实验选择最适IPC方法)，每组大鼠均为8只。其中失血性休克对照组和IPC组于复制失血性休克模型前、剥离大鼠SMA主干，分别在休克前，休克后10 min、30 min、1 h、2 h、3 h和4 h经股静脉给予NE(3 μg/kg),记录大鼠使用NE前后股动脉压值，其差值即为NE作用后MAP变化，反映整体血管反应性；同时采用倒置显微镜(CK40，Olympus)观察并记录使用NE 前后大鼠SMA主干管径的变化,以使用NE前后大鼠SMA管径差值占使用NE前大鼠SMA管径的百分率(%)来评价大鼠SMA对NE的收缩反应性。假手术组除不放血外，其它处理同失血性休克对照组。

4IPC对失血性休克大鼠离体SMA血管反应性和钙敏感性的影响

完善科研项目经费预算管理，首先要提高项目负责人和财务部门对项目预算的认识，再依据实际情况编制更加科学合理的科研项目经费预算和按照规定流程调整预算。

104只大鼠随机分为假手术组、失血性休克对照组和IPC组，其中失血性休克对照组和IPC组又根据休克时相点分为休克10 min、30 min、1 h、2 h、3 h和4 h 6个亚组，每组大鼠均为8只。处死大鼠取SMA，清除周围结缔组织，制作成2-3 mm长的血管环2根,其中1根用于血管反应性测定,另1根用于钙敏感性测定。

将所取SMA血管环挂于注有Krebs-Henseleit液[K-H液(mmol/L)：NaCl 118， KCl 4.7，NaHCO325，KH2PO41.03 ，MgSO4·7H2O 0.45，CaCl22.5，葡萄糖11.1，pH 7.4]离体器官灌流槽的浴槽中，持续充入95%O2和5%CO2混合气体，给预初张力0.5 g，37 ℃恒温孵育2 h，每20 min换液1次,待张力曲线平稳后,测定血管环对NE的反应性。血管环张力通过张力传感器连接至八道生理记录仪(Power Lab，AD Instrument)记录。按累积浓度法向浴槽K-H液中依次加入NE，使其终浓度分别为0.001、0.01、0.1、1.0和10 μmol/L。记录不同NE浓度下 SMA环产生的最大收缩力。以NE浓度和血管环单位组织湿重产生的张力(kg/g)作量-效曲线,曲线拟合法求NE的最大反应(Emax)和pD2 (达到50%最大反应时激动剂浓度的负对数-logEC50)，以NE的Emax和pD2 及量-效曲线评价血管对NE的反应性。

将所取SMA血管环挂于注有K-H液中孵育2 h,方法同前,待张力曲线平稳后,换用高钾液(mmol/L：NaCl 2.7，KCl 120，NaHCO325，KH2PO41.03，MgSO4·7H2O 0.45，葡萄糖11.1，pH 7.4)孵育15 min，待张力曲线平稳后，测定血管环对Ca2+的反应性。按累积浓度法向浴槽高钾液中依次加入CaCl2，使其终浓度分别为0.03、0.1、0.3、1、2、6、10和30 mmol/L，记录不同Ca2+浓度下SMA环产生的最大收缩力。以Ca2+浓度和血管环单位组织湿重产生的张力(kg/g)作量-效曲线,曲线拟合法求Ca2+的Emax和pD2，以Ca2+反应的Emax和pD2及量-效曲线评价血管对Ca2+的反应性。

5统计学处理

结 果

1不同IPC方法对失血性休克大鼠24h存活率和存活时间的影响

各组大鼠体重和失血量间无显著差异(P>0.05)。IPC Ⅰ组存活大鼠为6/10，与休克对照组的3/10和其它预处理组的2/10、4/10相比有显著差异，且存活时间较休克对照组也明显延长(P<0.05)。而IPC Ⅱ、Ⅲ组24 h存活率和存活时间与休克对照组相比则无明显差异(P>0.05)。基于上述结果，我们在后续实验中选择的IPC的方法为：夹闭腹主动脉1 min，开放5 min，重复3次,见图1。

图1不同IPC方法对失血性休克大鼠24h存活率和存活时间的影响

2IPC对失血性休克大鼠NE升压效应的影响

2.1IPC对失血性休克大鼠NE升压效应的影响 随着休克时间的延长，休克对照组大鼠给予NE后MAP上升幅度明显下降，与假手术组比较，在休克3 h和4 h，MAP上升幅度分别降至假手术组的36.1% 和24.5%,P<0.01。IPC可明显增加休克后期NE升压效应，在休克3 h和4 h，IPC组大鼠给予NE后MAP上升幅度分别为休克对照组的1.84倍和2.19倍,见图2A。

图2IPC对失血性休克大鼠NE升压效应的影响(A)及IPC对在体SMA收缩反应性(B)的影响

2.2IPC对失血性休克大鼠在体SMA对NE收缩反应性的影响 随着休克时间的延长，失血性休克后大鼠在体SMA对NE的收缩反应性明显下降，在休克3h和4 h，休克对照组大鼠SMA收缩反应仅为假手术组的20.3%和15.2%；而IPC可明显改善休克大鼠SMA对NE的收缩反应性，在休克3 h和4 h，IPC组大鼠SMA对NE的收缩反应性分别为休克对照组的2.62倍和3.41倍,见图2B。

3IPC对失血性休克大鼠血管收缩反应性和钙敏感性的影响

3.1失血性休克后大鼠离体SMA收缩反应性和钙敏感性的变化 血管反应性：与正常对照组比较，失血性休克后，肠系膜上动脉血管反应性呈先升高后降低的双相变化，即休克即刻血管反应性升高，表现为量-效曲线左移，对NE的Emax增加为假手术组的142.3% (P<0.01)。随着休克时间的延长，血管反应性进行性下降，在休克后3 h和4 h，量-效曲线明显右移，对NE的Emax显著降低，分别为假手术组的42.5%和33.3%,P<0.01,见图3 A、C、E。

图3失血性休克后血管反应性和钙敏感性的变化

血管钙敏感性：与正常对照组比较，失血性休克后，肠系膜上动脉血管钙敏感性在休克即刻无明显变化(P>0.05)。随着休克时间的延长，钙敏感性逐渐下降，休克30 min、1 h、2 h、3 h、4 h对钙的Emax分别降低至假手术组的70.4%、70.3%、77.2%、59.5%和57.0% ，P<0.05或P<0.01,见图3 B、D、F。

3.2IPC对失血性休克大鼠SMA血管反应性和钙敏感性的影响 在休克早期(休克即刻)，IPC组SMA对NE的收缩反应性和钙敏感性较失血性休克对照组明显下降(P<0.05)，但与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)；在休克后期(休克2 h、3 h、4 h)，IPC组SMA对NE的收缩反应性和钙敏感性较失血性休克对照组显著增加(P<0.05)，且IPC组SMA的钙敏感性与正常对照组比较无显著差异(P>0.05),见图4。

讨 论

预处理是指在暴露于一种短期的应激状态(缺血、缺氧、热休克等)及某种生化或药理试剂后，组织对随后损伤(如缺血、缺氧性损伤)所获得的一种保护性反应。大量研究显示缺血和药物预处理对心脏、脑、肾脏、骨骼肌、小肠[3-7]等器官的缺血再灌注

图4IPC对失血性休克大鼠SMA血管反应性和钙敏感性的影响

损伤有明显的保护作用，具有一定的器官普遍性。近年来研究发现，IPC和药物预处理作为一种自我保护机制，可有效防止休克时组织低灌注和组织缺氧所致的休克后器官损伤和功能障碍。但目前关于预处理对失血性休克后血管功能是否有保护作用，尚不清楚。

IPC在其短暂缺血过程中释放出神经内分泌或旁分泌物质，如腺苷、缓激肽、儿茶酚胺、前列腺素等作用于相应膜受体，这些受体激活后与跨膜G蛋白耦联，通过不同的胞内信号通路，活化PKC、PKG等，开放线粒体ATP敏感性钾通道(mKATP)和线粒体钙激活钾通道(mBKCa)，关闭线粒体通透性转换孔(mitochondral permeability transition pore,mPTP)，保护线粒体和细胞功能，发挥预处理保护作用。在对血管的预处理保护研究中发现，对离体的猪冠状动脉血管环采用缺氧5 min，复氧10 min，重复2次的缺氧预处理方法，可显著恢复随后长时间缺氧导致的冠状动脉内皮依赖性血管舒张反应性及由KCl 诱导血管收缩反应性的损伤[8]。Zhen等[9]也报道了缺氧预处理和KATP通道开放剂KRN4884可以减轻由内皮源性超极化因子介导的血管舒张反应。在本研究中，我们应用不同的IPC方法，观察失血性休克大鼠24 h存活率和存活时间，结果发现夹闭腹主动脉1 min，开放5 min，重复3次的IPC方法可明显提高休克大鼠24 h存活率和存活时间。同时在体实验发现IPC能显著增加失血性休克大鼠NE的升压效应和休克大鼠SMA对NE的收缩反应性，在休克3 h和4 h，IPC组大鼠给予NE后MAP上升幅度分别为休克对照组的1.84倍和2.19倍，SMA收缩幅度分别为休克对照组的2.62倍和3.41倍；离体实验则发现IPC组在休克早期(休克即刻和30 min)血管对NE的收缩反应性明显低于休克对照组，这可能有助于组织灌注；而在休克中、后期(休克2 h、3 h、4 h)血管反应性明显高于休克对照组，这些结果均提示IPC诱导了休克后期血管低反应性的保护效应，并可通过改善血管反应性降低休克所致的死亡率。

IPC是如何诱导失血性休克后期血管低反应性保护效应的呢？从休克后血管低反应性的发生机制来看，目前认为除了受体失敏和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)膜超极化外，休克后VSMCs肌肉收缩蛋白钙失敏在休克后血管低反应性的发生中也具有重要作用[10]。本研究结果也显示失血性休克后大鼠SMA钙敏感性在休克后30 min即出现明显下降，之后随着休克时间的延长呈进行性下降。而IPC后休克后期钙敏感性同血管反应性一样均较休克对照组明显升高，提示IPC可能通过恢复钙敏感性发挥对血管反应性的保护作用。但IPC是如何恢复钙敏感性，是否与调节钙敏感性的重要分子Rho激酶、PKC和PKG有关，还有待进一步研究。

我们的实验显示IPC后休克后期血管反应性较休克对照组明显升高，但仍明显低于正常对照组；而血管钙敏感性较休克对照组明显升高，接近正常对照组水平，这提示在休克后期血管反应性下降的发生机制中，除了非钙依赖性途径/钙敏感性途径外，钙依赖性途径调节的血管平滑肌收缩力下降在其中可能也有重要作用。

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《中国病理生理杂志》编辑部

Effectofischemicpreconditioningonvascularreactivityandcalciumsensitivityinhemorrhagicshockrats

HU Yi1, LI Tao2, XU Jing2, TANG Xiao-feng1, LIU Liang-ming2

(1DepartmentofAnesthesiology,2StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnsandCombinedInjury,Department2,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:liangmingliu@yahoo.com)

AIM: To investigate the effect of ischemic preconditioning (IPC) on vascular reactivity and calcium sensitivity during hemorrhagic shock.METHODSAppropriate method of IPC was selected by observing the effect of different strategies of IPC on the survival time and the survival rate in hemorrhagic shock rats. The effect of IPC on the pressor effect of norepinephrine (NE, 3 μg/kg) and the contractile response of superior mesenteric artery (SMA) to NE and calciuminvivoandinvitrowere observed.RESULTSAmong 3 strategies of IPC, 3 cycles of abdominal aorta occlusion for 1 min and loosing for 5 min increased the survival time and 24 h survival rate significantly, which was superior to the other two IPC methods.Invivo, IPC significantly increased the pressor response to NE and the contractile response of SMA to NE (P<0.01).Invitro, IPC significantly improved the reactivity of SMA to NE and Ca2+. The Emaxvalues of SMA to NE and Ca2+in IPC group were significantly higher than that in shock control group (P<0.01).CONCLUSIONIschemic preconditioning reverses Shock-induced vascular hyporeactivity via improving calcium sensitivity of the vasculatures.

Ischemic preconditioning; Shock,hemorrhagic; Vascular reactivity; Calcium sensitivity

R363

A

1000-4718(2011)03-0437-06

2010-08-02

2010-12-17

国家杰出青年基金资助项目(No.30625037)

△通讯作者Tel:023-68757421；E-mail: liangmingliu@yahoo.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.004