哮喘儿童支气管肺泡灌洗液IL-17、IL-8和VEGF水平测定及意义*

赵灵芝， 卢美萍

(浙江大学医学院附属儿童医院呼吸科，浙江 杭州 310003)

·短篇论著·

哮喘儿童支气管肺泡灌洗液IL-17、IL-8和VEGF水平测定及意义*

赵灵芝， 卢美萍△

(浙江大学医学院附属儿童医院呼吸科，浙江 杭州 310003)

目的Th17细胞是以分泌IL-17为主的新型T细胞亚群，其在哮喘中的作用尚不十分清楚。本文通过观察哮喘急性发作儿童支气管肺泡灌洗液(BALF)IL-17、IL-8、血管内皮生长因子(VEGF)等的水平变化，探讨其在哮喘急性发作儿童气道炎症中的作用。方法我院2009年2月-2009年12月期间行纤维支气管镜检查患儿共88例，包括哮喘急性发作组(哮喘组，n=52)、非喘息组(肺炎组，n=25)及对照组(n=11)，收集所有病例的BALF，进行细胞学分类，ELISA法测定BALF中细胞因子IL-17、IL-8、VEGF、IL-4、IFN-γ和IL- 4/IFN-γ水平。结果与对照组比较，哮喘组和肺炎组患儿的IL-17和IL-8水平均明显增高(均P<0.05)；哮喘组患儿的IL-8水平较肺炎组低(P<0.05)，而2组IL-17水平无显著差异(P>0.05)；与肺炎组和对照组比较，哮喘组患儿VEGF水平明显增高(均P<0.01)；肺炎组与对照组患儿VEGF水平无显著差异(P>0.05)；3组患儿的IL-4，IFN-γ和IL-4/IFN-γ水平均无显著差异(均P>0.05)。与对照组比较，哮喘组及肺炎组患儿中性粒细胞百分比明显增高(均P<0.01)，而哮喘组与肺炎组患儿的中性粒细胞百分比无显著差异(P> 0.05)。结论IL-17、IL-8及VEGF在哮喘儿童气道炎症中发挥重要作用，Th17细胞可能参与儿童哮喘急性发作的发病机制。

哮喘； 儿童； 支气管肺泡灌洗液； 白细胞介素 17； 细胞因子类

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种炎症细胞、炎症介质及细胞因子参与的常见儿童气道炎症性疾病。2009GINA数据显示，全球约有3亿人口罹患哮喘，根据不同国家的不同诊断标准，患病率高达1%-18%，包括哮喘的儿童、成人以及喘息患儿。但是，关于儿童哮喘的发生机制仍未完全明了，儿童哮喘是否存在气道重塑尚存在争议。随着儿童纤维支气管镜的开展，与血标本相比，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的获得为我们的研究提供了更直接可靠的数据。Th17细胞是以分泌IL-17为主的新型T细胞亚群，近年研究发现其与过敏性疾病的炎症反应相关；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)过量表达可促使气道黏膜血管的新生和数目增多，参与哮喘气道的血管重塑过程[1]，但关于其在儿童哮喘急性发作中的作用则报道较少。本研究将通过观察哮喘急性发作患儿BALF中IL-17、VEGF、IL-8、IL-4和IFN-γ水平的变化，探讨IL-17及相关细胞因子在哮喘儿童气道炎症中的作用。

材 料 和 方 法

1对象

88例行纤维支气管镜检查的患儿，均为我院2009年2月-2009年12月期间的住院患儿。病例分为3组：(1)哮喘急性发作组(哮喘组，n=52)：男37例，女15例，年龄7个月-12岁8个月，平均年龄1岁11个月。均符合2008年中华医学会儿童支气管哮喘防治指南[2]，患儿入院时均有喘息症状，听诊可闻及哮鸣音，既往喘息≥2次，并经纤维支气管镜等检查排除支气管异物，喉软化、气管支气管狭窄等先天性气道异常引起的喘息；(2)非喘息组(肺炎组，n=25)：其中男18例，女7例，年龄11个月-12岁11个月，平均年龄2岁。患儿入院时均符合肺炎诊断标准，但无喘息症状，听诊无哮鸣音，既往无喘息或哮喘病史，无个人及家族过敏史；(3)对照组(n=11)：其中男8例，女3例，年龄10个月-9岁6个月，平均年龄2岁1个月，6例经纤维支气管镜检查诊断为支气管异物，病程均小于3 d，另5例为甲状腺囊肿或眼睑外翻外科手术非感染患儿，既往均无喘息或哮喘病史，无个人及家族过敏史，除外心、肝、肾、血液等系统的慢性疾病。各组间年龄、性别比较，差异均无显著(P>0.05)。

2方法

2.1病史采集 患儿入院时详细询问病史，包括个人及家族过敏史，既往喘息史。

2.2BALF的收集及处理 患儿入院2-5 d内(急性期)行纤维支气管镜检查。哮喘组、肺炎组及外科手术对照组患儿多选右肺中叶或左肺舌叶，或者局限性支气管肺部病变相应的支气管肺段进行灌洗，支气管异物对照组患儿选择病灶的对侧肺进行灌洗，灌洗液选用37 ℃灭菌生理盐水，每次灌洗量为0.5 mL/kg，共3次，每次回收应大于60%。将回收的灌洗液用2层纱布过滤黏液，立即置4 ℃、4 000 r/min离心15 min。离心后取上清液，冻存于-80 ℃冰箱中待检，沉淀用于细胞学分类计数。

2.3ELISA法检测BALF上清液中的 IL-17、IL-8、VEGF、IL-4与IFN-γ IL-17试剂盒购自R&D。IL-8、VEGF试剂盒购自RayBiotech。IL-4和IFN-γ试剂盒购自上海明睿生物技术有限公司，采用ELISA方法按各说明书操作，单位为ng/L。

2.4BCA法检测BALF上清液中的蛋白含量 采用Bicinchoninic acid (BCA)法测定BALF上清中的总蛋白含量，单位为g protein/L。

2.5BALF细胞学分类 将剩余的少许上清液及沉淀振荡10 s混匀，取1滴置玻片上涂成均匀薄片，室温干燥后甲醇固定2-3 min，置瑞氏姬姆萨染色剂中染色10-15 min，取出清水冲洗2-3 min，加1滴甘油后置显微镜下观察计数，中性粒细胞的胞质呈无色或极浅的淡红色，有许多弥散分布的细小的浅红或浅紫色的特有颗粒, 细胞核呈杆状或分叶状；嗜酸性粒细胞的胞质充满粗大的鲜红色嗜酸性颗粒；巨噬细胞比前2种细胞略大，胞核较小，胞质呈嗜酸性，有明显的吞噬小泡；淋巴细胞一般形态较小，胞核大而圆，染色深，胞质少，呈天蓝色。

3统计学处理

由于数据呈偏态分布(IL-4为正态分布)，IL-17、IL-8、VEGF、IL-4和IFN-γ数据以中位数(四分位差)，即M(Qd)表示，单位为ng/g protein；细胞学分类数据以中位数(四分位差)表示，即M(Qd)，单位为%。用SPSS统计软件(16.0)进行数据处理，采用秩和检验。

结 果

1各组间BALF中IL-17水平变化

与对照组比较，哮喘组患儿和肺炎组患儿的IL-17水平显著增高[35.85(10.75)ng/g proteinvs42.95(24.1) ng/g protein，35.85(10.75) ng/g proteinvs42.95(16.05) ng/g protein，均P< 0.05]；而哮喘组与肺炎组患儿IL-17水平无显著差异[42.95(24.1) ng/g proteinvs42.95(16.05) ng/g protein，P>0.05]，见图1A。

2各组间BALF中IL-8水平变化

与对照组比较，哮喘组和肺炎组患儿IL-8水平明显增高[515.25(508.90) ng/g proteinvs945.05(1 277.35) ng/g protein，515.25(508.90) ng/g proteinvs1 544.85(1 429.50) ng/g protein，均P< 0.05]；而肺炎组IL-8水平较哮喘组增高更显著[1 544.85(1 429.50) ng/g proteinvs945.05(1 277.35) ng/g protein，P< 0.05),见图1B。

3各组间BALF中VEGF水平变化

哮喘组患儿VEGF水平较肺炎组及对照组均明显增高[1 250.45(1353.30) ng/g proteinvs643.00(900.90) ng/g protein，1 250.45(1 353.30) ng/g proteinvs561.80(979.35) ng/g protein，均P< 0.01]，而肺炎组与对照组患儿VEGF水平无显著差异[643.00(900.90) ng/g proteinvs561.80(979.35) ng/g protein，P>0.05] ，见图1C。

4各组间BALF中IL-4、IFN-γ和IL-4/IFN-γ水平变化

对照组、哮喘组及肺炎组患儿的IL-4水平分别为77.95(17.75) ng/g protein、80.30(16.45) ng/g protein 和78.40(12.80) ng/g protein，3组之间比较无显著差异，均P>0.05；IFN-γ水平分别为36.50(15.75) ng/g protein、41.25(6.90) ng/g protein和 42.65(20.15) ng/g protein，3组之间比较无显著差异，均P>0.05；IL-4/IFN-γ比值分别为0.46(0.25)、0.54(0.15)和0.57(0.19)，3组之间比较无显著差异，均P>0.05 ，见图1D。

Figure 1. The levels of IL-17, IL-8, VEGF, IL-4 and IFN-γ in BALF in children. Compared with the control, levels of IL-17 and IL-8 were significantly elevated in asthma and pneumonia group (allP<0.05). Compared with pneumonia, there was a lower level of IL-8(P<0.05) in patients with asthma (Fig 1A, 1B). Compared with pneumonia or control group, the level of VEGF was significantly increased in asthma group (bothP<0.01)(Fig 1C). There was no statistical difference in the levels of IL-4 or IFN-γ among groups(Fig 1D). Each bar represents the M(Qd).Control:n=11;asthma:n=52; pneumonia:n=25.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vspneumonia group.

图1各组BALF中细胞因子IL-17、IL-8、VEGF、IL-4和IFN-γ表达水平

5各组BALF细胞学分类

与对照组比较，哮喘组和肺炎组患儿BALF中性粒细胞百分比明显增高[1.91(1.64) %vs22.38(25.22) %，1.91(1.64) %vs29.12(25.15) %，均P<0.01]，而哮喘组与肺炎组患儿比较差异无显著[22.38(25.22) %vs29.12(25.15) %，P>0.05]；与对照组比较，哮喘组和肺炎组患儿BALF巨噬细胞百分比显著降低[88.64(2.42) %vs64.12(25.46) %，88.64(2.42) %vs50.36(25.99) %，均P< 0.01]，而哮喘组患儿巨噬细胞百分比高于肺炎组 [50.36(25.99) %vs64.12(25.46) %，P<0.05]；与肺炎组比较，哮喘组和对照组患儿BALF淋巴细胞百分比均明显降低[18.76(19.40) %vs11.75(8.24) %，18.76(19.40) %vs9.09(2.47) %，均P<0.05]，哮喘组与对照组比较差异无显著[11.75(8.24) %vs9.09(2.47) %，P>0.05]；对照组、哮喘组和肺炎组患儿BALF嗜酸性细胞百分比分别为0.27(0.47) %、1.94(4.79) %和1.76(2.28) %，3组之间比较均无显著差异，见图2。

讨 论

以往研究者认为，哮喘是由Th2细胞和IgE介导的Ⅰ型变态反应性慢性气道疾病，其特点是嗜酸性粒细胞浸润的气道炎症[3]，小鼠哮喘模型的BALF中嗜酸性细胞比例可达60%-70%，而中性粒细胞不足5%-10%[4]。但目前越来越多的学者致力于中性粒细胞参与为主的“非Th2型哮喘”的研究，认为中性粒细胞参与哮喘的急性发病及恶化过程[5]。本研究结果也显示，与对照组比较，哮喘组儿童BALF的中性粒细胞显著增高，而嗜酸性粒细胞变化不明显，表明中性粒细胞而非嗜酸性粒细胞参与的气道炎症可能是导致儿童哮喘急性发作的主要原因之一。另一方面，感染而非过敏可能是儿童哮喘急性发作的诱因。

Figure 2. The percentage of cells in BALF in children. Compared with the control, there were higher percentages of neutrophil and lymphocyte but lower percentage of macrophage in BALF in asthma and pneumonia group (P<0.05 orP< 0.01). There was no statistical difference between asthma and pneumoniae groups(P>0.05). Each bar represents the M(Qd). Control:n=11;asthma:n=52;pneumonia:n=25.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vspneumonia group.

图2各组BALF中细胞分类情况

有研究显示，轻中型哮喘多以嗜酸性粒细胞浸润为主，而重型哮喘气道中性粒细胞比例显著增高[6]，而且气道中性粒细胞比例与病变程度呈正相关。已知IL-8对中性粒细胞具有很强的趋化和激活作用， IL-8可选择性趋化中性粒细胞，诱导和增强其脱颗粒及杀菌作用，同时活化的中性粒细胞也能产生IL-8，形成正反馈，进一步加重气道炎症，导致组织破坏[7]。最新研究还发现，另一新型的细胞因子，Th17细胞分泌的IL-17也参与哮喘气道中性粒细胞的增殖、成熟和趋化，且IL-17的表达与中性粒细胞性炎症程度呈正相关[8]。与之相反，在OVA致敏的小鼠模型中，IL-17对气道嗜酸性粒细胞募集所起的作用不大[9]，而且，在Th2细胞介导的哮喘激发期，IL-17能有效减少嗜酸性粒细胞的浸润[10]。因此，IL-17可能参与了“非嗜酸性哮喘”的致病过程，成为区分“Th2型哮喘”和“非Th2型哮喘”的重要标志。另外，IL-17还诱导人类气道上皮细胞产生IL-8，加强TNF介导IL-8的产生，间接参与气道的中性粒细胞炎症[11]。本研究结果显示，哮喘急性发作患儿BALF的中性粒细胞、IL-17和IL-8均明显增高，表明气道中性粒细胞浸润与儿童哮喘急性发作关系密切，IL-17和IL-8均在儿童气道炎症中发挥重要作用，可能参与哮喘急性发作儿童气道中性粒细胞而非嗜酸性粒细胞的趋化与浸润，本研究结果还显示，肺炎组患儿IL-17水平和中性粒细胞百分比也明显增高，而且肺炎组患儿IL-8水平显著高于哮喘组和对照组，表明IL-17和IL-8也参与非哮喘儿童的气道炎症。

气道黏膜下血管数目的增多、管径增粗以及新血管的形成是哮喘气道重塑的一个重要特征和关键环节。已知转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)蛋白家族和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在哮喘的气道重塑作用中发挥重要作用，但关于VEGF在哮喘气道重塑中的作用报道较少。Ribatti等[1]研究表明，VEGF过量表达可促使气道黏膜血管的新生和数目增多，导致血管容积及气道壁厚度的增加。Siddiqui等[12]研究还显示，VEGF不但参与了哮喘患者的血管重塑过程，而且上调Th2型气道炎症反应，黏液腺增生，诱导MMP-9的表达，趋化中性粒细胞及嗜酸性细胞，参与气道水肿和气道高反应性。本组数据表明，哮喘组VEGF水平显著高于肺炎组及对照组，提示在哮喘急性发作儿童中可能存在气道重塑，VEGF在其中发挥重要作用。另外，Kim等[13]研究发现，用含LPS致敏原致敏的非嗜酸性哮喘模型中，VEGF升高可通过上调Th1和Th17细胞分化因子，促使幼稚T细胞向Th1和Th17细胞分化。

尽管以往研究表明，Th2细胞优势应答在哮喘发病中发挥重要作用，并且有动物研究表明哮喘模型的血或BALF中IL-4及IL-4/IFN-γ比值明显上升[14]。但最新有研究表明，Th2细胞主要参与嗜酸性哮喘的免疫应答，而Th1和Th17细胞参与非嗜酸性哮喘的免疫应答[13]。本研究结果显示，在哮喘急性发作儿童BALF中Th2型细胞因子IL-4、Th1型细胞因子IFN-γ以及IL-4/IFN-γ比值未见明显上升，可能与本组病例年龄偏小(大多在3岁以内)、而且婴幼儿喘息大多为感染诱发有关，也进一步说明哮喘可能存在Th2介导的嗜酸性哮喘以外的、如Th17介导的非嗜酸粒细胞性哮喘的炎症反应。

综上所述，IL-17和IL-8在哮喘急性发作儿童气道炎症中发挥重要作用，Th17细胞可能参与儿童哮喘急性发作的发病机制，作用机制可能与其诱导气道中性粒细胞浸润有关。同时，VEGF参与哮喘急性发作患儿的气道重塑。

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LevelsofIL-17,IL-8andVEGFinbronchoalveolarlavagefluidinasthmachildren

ZHAO Ling-zhi, LU Mei-ping

(Children’sHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,China.E-mail:meipinglu@126.com)

AIM: To investigate the mechanism of airway inflammation in children with asthma by determining the levels of IL-17, IL-8 and vascular endothelial growth factor(VEGF) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF).METHODSEighty-eight children were enrolled in the study and divided into asthma group (n=52), pneumonia group (n=25) and control group (n=11). BALF were collected from all 88 cases. The levels of IL-17, IL-8, VEGF, IL-4 and IFN-γ in BALF were measured by ELISA. The cell types in BALF were determined.RESULTSCompared with the control, the levels of IL-17 and IL-8 were significantly elevated in asthma group and pneumonia group (allP<0.05). The level of IL-8 (P<0.05) in the patients with asthma was lower than that in the pneumonia patients. No statistical difference of the IL-17 level between asthma group and pneumoniae group was observed (P>0.05). Compared with pneumonia group and control group, the level of VEGF was significantly increased in asthma group (allP<0.01), and the VEGF level among control group and pneumonia groups was almost similar (P>0.05). The levels of IL-4 and IFN-γ, and ratio of IL-4/IFN-γ among groups were not statistically different. The percentage of neutrophils in BALF was significantly higher in asthma group and pneumonia group than that in control group (allP<0.01).CONCLUSIONIL-17, IL-8 and VEGF play important roles in airway inflammation in children with asthma. Th17 cells may participate in the pathogenesis of asthma in children.

Asthma; Child; Bronchoalveolar lavage fluid; Interleukin-17; Cytokines

R562.2+5

A

1000-4718(2011)03-0577-04

2010-09-27

2010-12-20

国家自然科学基金资助项目(No. 81070012)；浙江省自然科学基金资助项目(No.Y2090339 )

△通讯作者 Tel: 0571-87061007-70411; E-mail: meipinglu@126.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.030