缺血后适应对树鼩海马CA1区神经元Akt信号转导调控的机制研究*

汤 諹, 李树清, 李 凡, 李 飞, 张 颖

(1昆明医学院第一附属医院皮肤/医学美容科，云南 昆明 650032；2昆明医学院基础医学院病理生理教研室，云南 昆明 650031)

缺血后适应对树鼩海马CA1区神经元Akt信号转导调控的机制研究*

汤 諹1, 李树清2△, 李 凡2, 李 飞2, 张 颖2

(1昆明医学院第一附属医院皮肤/医学美容科，云南 昆明 650032；2昆明医学院基础医学院病理生理教研室，云南 昆明 650031)

目的了解缺血后适应(PC)对树鼩脑缺血时海马CA1区神经元磷脂酰肌醇-3激酶/Akt(PI-3K/Akt)下游底物丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt Ser-473/Thr-308)磷酸化(Akt[pS473]/Akt[pT308])的调控，探讨Akt信号转导通路在缺血PC脑保护中的作用机制。方法以树鼩为实验动物，用光化学诱导法复制局部脑缺血，并于脑缺血后3 h 30 min反复夹闭缺血侧颈总动脉3个循环(5 min 1个循环)以制备后适应模型。在光镜、电镜下观察海马CA1区神经元损伤及其超微结构变化的同时，采用免疫组化法了解脑缺血树鼩海马CA1区神经元Akt[pS473]/Akt[pT308]的分布及定位，并以灰度值检测磷酸化强度。结果脑缺血可导致树鼩海马损伤及细胞超微结构的明显异常；而缺血PC可使海马CA1区神经元超微结构的异常明显改善。免疫组化结果显示，对照组海马CA1区Akt[pS473]及 Akt [pT308]的磷酸化为阴性。缺血PC组与缺血组在不同时点的胞浆、胞膜均出现Akt[pS473]，但缺血72h Akt[pS473]减弱(灰度值146.6±2.9)。缺血组Akt [pT308]仅在4 h明显增强(灰度值135.5±2.2)，随后则未检测到(灰度值分别为165.3±3.7，163.3±2.5)。而缺血PC组4 h时点Akt [pT308]呈阴性，随后24 h、72 h则持续显著的阳性。结论缺血PC能明显减轻海马CA1区神经元的缺血性损伤，其保护机制可能与 Akt Ser-473和Thr-308 2个位点磷酸化导致PI-3K/Akt信号转导途径的激活有关。

脑缺血； 缺血后适应； 磷脂酰肌醇-3激酶/Akt； 信号转导； 树鼩

缺血后适应(ischemic postconditioning, ischemic PC)是一种在方法上与缺血预适应(ischemic preconditioning, IP)完全不同，但效果相似的细胞保护措施，缺血PC的发现提示：机体缺血状态下，内部天然的内源性保护机制的激活对机体的抗损伤反应具有特殊的生物学意义[1]。2003年Zhao等[2]在首次描述缺血PC时，发现在心肌缺血再灌注的早期使用短暂、重复的缺血能减小再灌注的损伤。Burda等[3]随后证实，在正确的时间应用最佳强度的PC能防止迟发性神经元死亡的过程，但有关PC保护神经元的机制尚不清楚。本研究通过比较树鼩血栓性脑缺血及后适应对磷脂酰肌醇-3激酶/Akt(phosphatidylinositol 3-kinase-Akt, PI-3K/Akt)信号转导通路下游底物-丝/苏氨酸蛋白激酶Akt[Ser-473]和Akt[Thr-308]磷酸化的影响，以探讨PI-3K/Akt信号转导在缺血PC脑保护中的病理生理机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 采用健康成年树鼩42只，雌雄不拘，体重(100±10)g。避光、安静、清洁环境饲养，随机分为对照组(假手术组，sham)、血栓性脑缺血4h组(ischemia 4 h)、缺血24 h组(ischemia 24 h)、缺血72 h组(ischemia 72 h)、缺血后适应4 h组(PC 4 h)、缺血后适应24 h组(PC 24 h)和缺血后适应72 h组(PC 72 h)，共7组(每组n=6)。

1.2主要仪器 本室研制的SQ-Ⅲ型光化学诱导脑血栓形成装置，由电源(含滤波电路及触发器)，光源、散热装置组成。光学系统主要由干涉滤镜及聚光镜组成。光源中心波长(λ=560 nm)，带宽(Δλ=60 nm)，光强度(10 W/cm2)，用时间继电器控制照射时间。Leica RM 2135石蜡切片机。奥林巴斯光学显微镜BX50 。HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)。Nikon-MiVnt显微图像分析系统(Nikon)。

1.3主要试剂 注射用硫喷妥钠(thiopental sodium for injection)为上海新亚药业有限公司产品；孟加拉红(rose Bengal)为Fluka产品；甲醛溶液(formaldehyd solution)为汕头市达濠精细化学品有限公司产品；0.01 mol/L磷酸盐缓冲液pH7.4(phosphate buffer saline, PBS)为福州迈新生物技术开发有限公司产品；多聚赖氨酸(poly-L-lysine)为福州迈新生物技术开发有限公司产品； Tween-20和EDTA Na2北京索来宝科技有限公司产品；10%山羊血清(goat serum)为晶美生物工程有限公司；Ⅰ抗 phospho-Akt(Ser473)mouse mAb及Ⅰ抗 phospho-Akt(Thr308)rabbit mAb购自Cell Signaling Technology； Ⅱ抗 MaxVisionTM即用型试剂、快速型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物及DAB显色液为福州迈新生物技术开发有限公司产品。

2方法

2.1光化学诱导法复制血栓性脑缺血动物模型[2]将动物腹腔注射1%硫喷妥钠溶液(5 mL/kg BW)麻醉固定，自舌下静脉注入1.5 g/L 孟加拉红溶液(1.33 mL/kg BW)，常规消毒后，自右耳屏前至右眼外眦作切口，切开皮肤、颞肌、显露树鼩颅骨，透过树鼩颅骨可见清晰的颅内血管影像，将动物置于SQ-Ⅲ型脑血栓形成实验装置下，经特殊波长的光束(强度为1.0 W/cm2)透过树鼩半透明颅骨照射脑血管15 min，复制血栓性脑缺血模型，照射结束后，缝合动物头颅部创口，保暖入笼。

2.2树鼩海马缺血PC模型的建立 在光化学法制备血栓性脑缺血模型基础上，在既定时点(4 h)前40 min，用1%硫喷妥钠(2.5 mL/kg BW)重新麻醉动物，动物仰卧固定，颈部正中作纵形切口，切开皮肤、皮下组织、颈阔肌，在右侧胸锁乳突肌前缘分离进入颈鞘，保护迷走神经与颈内静脉，分离颈总动脉，过线，在既定时点(4 h)前30 min以无创动脉夹在甲状软骨上缘平面夹闭颈总动脉5 min后去除动脉夹再灌5 min，重复3次以复制缺血PC模型，术后缝合动物颈部创口，保暖入笼。

2.3脑恒压灌流与内固定 在脑缺血后不同时点(4 h、24 h和72 h)以及缺血后适应后不同时点(4 h、24 h和72 h)麻醉动物，用手术剪剪开腹腔，结扎降主动脉，开胸并剪开心包，左心室插入聚乙烯管，使其进入升主动脉，扎闭主动脉根部以防回流，剪开右心耳，灌注预冷的生理盐水300 mL，待肝脏呈现蜡黄色时在120 mmHg 压力下缓慢滴注(25 gtt/min)固定液10%甲醛100 mL行内固定，滴注持续1 h，随后将脑组织取出，浸泡于10%甲醛溶液中行后固定30 min，将脑组织移至新鲜配制的10%甲醛溶液中继续固定至24 h，于视交叉后1.7-4.0 mm(海马齿状回互包平面)行冠状切片，取中间切块递级脱水、透明、浸蜡，常规石蜡包埋制成蜡块标本，储存于4 ℃冰箱备用。

2.4Akt [pS473]和Akt [pT308]免疫组织化学检测 蜡块标本连续切片，切片厚度5μm，贴片于多聚赖氨酸原液预处理的载玻片上，切片移至55 ℃恒温箱内烤片4-6 h，将组织切片脱蜡，置入100%二甲苯中室温孵育3次，每次5 min；将切片置入100%乙醇溶液内洗片2次，95%乙醇溶液内洗片2次后，将切片移入去离子水内5 min再水化，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)1 000 mL内煮沸15 min，进行抗原修复，自然冷却至40 ℃后用去离子水洗切片3次，3% H2O2室温孵育10 min；去离子水洗切片2次，1×PBST工作液洗切片5 min；每样本加入200μl，置湿盒内室温封闭1 h，甩干封闭液，加入以封闭液(5%山羊血清)配制的Ⅰ抗100 μL，置湿盒内4 ℃孵育过夜，1×PBST工作液洗切片3次，每次5 min，加入Ⅱ抗置湿盒内室温孵育25 min，1×PBST洗切片3次，每次5 min，新鲜配制DAB显色8 min，去离子水冲洗终止显色，苏木素核复染4 min，递级乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。奥林巴斯BX50光学显微镜下观察，阳性反应部位呈现棕黄色(DAB显色)，利用Nikon-MiVnt显微图像分析系统检测灰度值，进行Akt [pS473]和Akt [pT308]表达强度分析。实验对照组用PBS代替I抗，其余步骤相同。制作完成的切片储存于避光干燥之处，各组动物同时切片，并同时进行免疫组化染色。以保证实验条件的一致性。

2.5电镜取材及组织固定 在血栓性脑缺血后不同时点及缺血后适应不同时点麻醉动物，快速断头取脑，取缺血侧及对侧海马CA1区组织，置于3.5%

戊二醛内固定，固定瓶置4 ℃冰箱内保存，用磷酸缓冲液冲洗后，丙酮酸逐级脱水，1%四氧锇酸固定24 h，LKB5型超薄切片机半薄切片定位，随后作柠檬酸铅醋酸铀双染色，在JEM-100CX型电子显微镜下观察。

3统计学处理

结 果

1缺血PC对树鼩血栓性脑缺血海马神经元超微结构的影响

1.1正常对照及脑缺血组海马CA1区神经元的形态学 对照组海马CA1区神经元形态正常，排列正常；线粒体形态正常，偶尔可见线粒体轻度肿胀，内质网排列规则，粗面内质网核糖体清晰完整，高尔基体结构正常，分布均匀，见图1 A、B。实验结果可见，血栓性脑缺血后海马超微结构的改变以脑缺血后24 h最为明显，可见海马CA1区神经元出现固缩，在海马周围固缩细胞增多，线粒体肿胀，线粒体嵴消失或呈空泡状，内质网扩张、池形成,见图1 C、D；脑缺血后72 h超微结构的改变减轻，线粒体轻度肿胀、嵴部分消失，内质网轻度扩张(图略)。

Figure 1. The neuronal ultrastructure in hippocampus CA1 area under the electronic microscope. A:the normal neuron in hippocampus with regular arrangement(×8 000);B:the normal mitochondria in intracytoplasm and the clear cell spaces(×25 000);C:obviously mitochondria swelling and partly disruption and vanishing of mitochondrial cristae 24 h after thrombotic cerebral ischemia(×30 000); D:the intensive Golgi’s body and the vague limit between subcellular structure 24 h after thrombotic cerebral ischemia(×20 000);E:the extenuation of mitochondria swelling and some normal mitochondria 24 h after ischemic PC(×25 000);F:lightly expanding of endoplasmic reticulum 24 h after ischemic PC(×25 000).

图1电镜下神经元超微结构

1.2缺血PC对树鼩血栓性脑缺血海马神经元超微结构的影响 在缺血后适应24 h可见海马CA1区少量神经元出现固缩改变，部分细胞可见异染色质增多，残体出现；线粒体肿胀、嵴部分消失，但多数线粒体形态正常；内质网排列基本正常，部分内质网扩张，见图1 E、F；缺血后适应72 h线粒体及内质网的结构接近正常(图略)。

2缺血PC对树鼩血栓性脑缺血海马CA1区神经元Akt[pS473]及Akt[pT308]表达的影响

2.1海马CAI区神经元Akt[pS473]及[pS473]及Akt[pT308]的免疫组化检测 对照组海马CA1区Akt[pS473]及 Akt [pT308]的表达均为阴性，见图2、3。在缺血PC组与缺血组在不同时点均出现Akt[pS473]的胞浆、胞膜表达，见图2、3。但缺血组72 h Akt[pS473]的表达减弱。缺血组Akt [pT308]仅4 h呈阳性表达，随后则为阴性表达。而缺血PC组Akt [pT308]4 h呈阴性表达，随后24 h和72 h则持续阳性表达。

2.2海马CA1区神经元Akt[pS473]及Akt[pT308]灰度值测定 脑缺血4 h、24 h和72 h海马 Akt[pS473]的灰度值分别为133.5±3.3、133.5±3.1和146.6±2.9，均显著低于对照组(P<0.01)，但各时点之间的灰度值无显著差异(P>0.05)；缺血PC组4 h的灰度值高于缺血组(P<0.01)，但低于对照组，见表1。脑缺血4 h、24 h和72 h海马 Akt[pT308]灰度值分别为135.5±2.2、165.3±3.7和163.3±2.5，除缺血组4 h显著低于对照组外(P<0.01)，缺血组24 h及72 h的灰度值与对照组比较无显著差异。缺血PC组4 h的灰度值明显高于缺血组(P<0.01)，但缺血PC 24 h和72 h则明显低于缺血组(P<0.01)，见表2。

Figure 2. Distribution of Akt[pS473] in pyramid cells of hippocampus in CA1 area (immunohistochemical staining, ×400). The Akt[pS473] in sham group was negative. The Akt[pS473] was positive in cytoplasm and membrane of pyramid cells after cerebral ischemia and cerebral ischemic PC，but the intensity of Akt[pS473] decreased 72 h after ischemia.

图2海马CA1区锥体细胞Akt[pS473]的分布

Figure 3. Distribution of Akt[pT308] in pyramid cells of hippocampus in CA1 area (immunohistochemical staining, ×400). The Akt[pT308] in sham group was negative. The Akt[pT308] was positive 4 h after cerebral ischemia, but negative at 24 h and 72 h. The Akt[pT308] in ischemic PC group was negative at 4 h, but obviously positive at 24 h and 72 h.

图3海马CA1区Akt[pT308]的分布

表1缺血PC对脑缺血树鼩海马CA1区神经元Akt[pS473]灰度值的影响

Groups4h24h72hSham162．8±3．8NDNDIschemia133．5±3．3∗∗133．5±3．1∗∗146．6±2．9∗∗IschemicPC154．5±2．9△△132．5±2．7134．7±3．0

ND: not detected.**P<0.01vssham;△△P<0.01vsischemia.

表2缺血PC对脑缺血树鼩海马CA1区神经元Akt[pT308]灰度值的影响

Group4h24h72hSham165．5±2．7NDNDIschemia135．5±2．2∗∗165．3±3．7163．3±2．5IschemicPC163．5±2．3△△137．7±3．1△△132．0±3．2△△

ND: not detected.**P<0.01vssham;△△P<0.01vsischemia.

讨 论

脑缺血PC是近年新兴的探索领域，有关PI-3K /Akt在缺血状态下的细胞生存分子机制的研究且备受关注。业已证明，磷脂酰肌醇3激酶/Akt (phosphatidylinositol 3-kinase /Akt，PI-3K /Akt)信号转导途径是细胞生存的重要途径之一，在促进细胞生存，抑制细胞凋亡过程中具有重要作用。Akt是PI-3K信号转导途径中重要的靶激酶，在PI-3K介导的信号转导途径中，Akt信号转导通路通过对凋亡的调节作用促进细胞的生存。

本研究应用免疫组化检测了缺血组与缺血后适应组海马神经元Akt[pS473]及Akt[pT308]表达的定位及半定量改变，并对照电镜超微结构相应的结果分析Akt[pS473]及Akt[pT308]表达是否与细胞结构损伤有关。

免疫组化结果显示，对照组海马CA1区Akt[pS473]的表达为阴性，而大脑皮质可观察到Akt[pS473]在胞浆的弱阳性表达(另文)。比较缺血后适应组与缺血组，虽然二者在不同时点都出现Akt[pS473]的胞浆、胞膜表达，但在缺血组72 h Akt[pS473]的表达已经减弱(灰度值146.6±2.9)。正如Pignataro等[4]报道缺血后适应的神经保护效应部分源于Akt的磷酸化。Wang等[5]和Scartabelli等[6]通过使用Akt激酶的抑制剂，间接证实了PI-3K/Akt信号转导途径在缺血后适应对神经元的保护机制中可能起着关键作用。

Akt 的完全激活受到双重调控[10-12]：(1)Akt转位到质膜上；(2)Akt的Thr-308和Ser-473磷酸化。Akt信号通路的完全激活，应包括Akt Ser-473和Thr-308两个位点同时磷酸化，而既往研究主要集中在Akt[pS473]，而对Akt [pT308]的状况报道不多，本文的数据显示，缺血组Akt [pT308]仅在4 h有阳性表达(灰度值135.5±2.2)，随后24 h、72 h则表达为阴性(灰度值分别为165.3±3.7、163.3±2.5)。而后适应组则不同，4 h时点Akt[pS473]开始表达，但强度有限(灰度值154.5±2.9低于对照组，与缺血72 h无显著差异)。随后的24 h及72 h则表达增强并持续(灰度值分别为132.5±2.7和134.7±3.0)。相应的电镜下细胞结构显示，在缺血组24 h时点，海马CA1区神经元出现固缩，海马周围固缩细胞增多，线粒体肿胀，嵴消失或呈空泡状，内质网扩张，内质网池形成，胞浆水肿；海马周围组织水肿、变性、坏死和出血，见图1 C、D。而在缺血后适应组24 h时点，电镜下仅见海马CA1区少量神经元出现固缩改变，部分细胞可见异染色质增多，残体出现；线粒体肿胀、嵴部分消失，但多数线粒体形态正常；内质网排列基本正常，见图1 E、F。根据以上现象分析，短暂性脑缺血活化了细胞死亡和细胞生存激酶途径，Akt[Ser-473和Thr-308个位点的磷酸化，使得Akt信号通路完全激活，多种神经营养因子通过激活PI-3K/Akt信号途径而抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用，这一机制在其他学者的研究中也得到相应共识[7-9]。

业已证明，通过反复3次夹闭颈总动脉可使海马局部脑血流量(regional cerebral blood flow,rCBF)在不输液、不用药的前提下逐步得以回升达正常时海马rCBF的56%以上水平。其PC机制可能包括“机械信号转导”和体内血液重新分布两方面。前者可能与夹闭血管及开夹时血流冲击所产生的机械信号转导有关；后者则由于腹腔内脏与脑血管α-受体分布不同，以及夹闭颈动脉引起减压反射的加压效应的结果[1]。细胞结构变化结果提示，脑缺血可直接导致海马神经元亚细胞结构损伤，其损伤的程度与Akt活化水平呈负相关关系，Akt活化水平高，则亚细胞结构的损伤程度减轻。缺血PC通过活化Akt，在缓解海马CA1区神经元的损伤而促进细胞生存中起着重要作用。

由于PI-3K/Akt途径涉及的下游靶激酶较为复杂，许多问题仍有待探讨。在下一步研究中，拟通过更精确的定量研究方法对照Akt[pS473]和Akt[pT308]在缺血和缺血后适应时的动力学变化，分析这种动力学变化是否与海马CA1区神经细胞凋亡存在因果关系。

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EffectsofischemicpostconditioningonneuronalAktsignalingpathwaysinhippocampusCA1areaaftercerebralischemiaintreeshrews

TANG Yang1, LI Shu-qing2, LI Fan2, LI Fei2, ZHANG Ying2

(1DepartmentofDermatology&MedicalCosmetology,TheFirstAffiliatedHospital,KunmingMedicalCollege,Kunming650032,China;2DepartmentofPathophysiology,KunmingMedicalCollege,Kunming650031,China.E-mail:shuqing591@hotmail.com)

AIM: To investigate the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt (PI-3K/Akt) Ser-473/Thr-308/ phosphorylation (Akt[pS473]/Akt[pT308]) and the intensity of the neurons in happocampus CA1 area under the conditions of thrombotic cerebral ischemia and postconditioning in tree shrews.METHODSThe thrombotic focal cerebral ischemia was induced by photochemical reaction in tree shrews. Two hundred and ten minutes after cerebral ischemia, ischemic postconditioning was established by repeated cliping of ipsilateral carotid. The distribution of Akt[pS473] and Akt[pT308], and neuronal ultrastructure in hippocampus CA1 area were observed by the methods of electronic microscopy and immunohistochemistry. The phosphorylation intensity was measured by determining the optical gray value.RESULTSThe photochemical reaction induced cerebral ischemia and resulted in obvious lesions in hippocampus CA1 neurons. The damages of ultrastructure in the hippocampus were diminished by postconditioning. Correspondingly, in ischemia group, although the Akt[pS473] showed positive during 72 h, the positive Akt[pT308] was only observed at the time point of 4 h, and went negative at the time points of 24 h and 72 h. In postconditioning group, Akt[pS473] at the time points of 4 h, 24 h and 72 h were positive,and Akt[pT308] at the time points of 24 h and 72 h was also positive.CONCLUSIONCerebral ischemia leads to neuron lesions in tree shrew hippocampus and the postconditioning decreases the damage. The Akt[pS473] and Akt[pT308] may play important roles in the protective mechanism.

Brain ischcemia; Ischmic postconditioning; Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt; Signal transduction; Tree shrew

R363

A

1000-4718(2011)03-0560-06

2010-08-23

2010-12-06

国家自然科学基金资助项目(No.30660056;No.30971171)；昆明医学院第一附属医院院内基金资助项目(No.2009BS09)

△通讯作者Tel：0871-5338591;E-mail: shuqing591 @hotmail.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.027