量子点免疫荧光技术检测EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在人肺癌组织中的表达意义*

潘 琦， 陈福春， 武百强， 鲍 军， 薛洁皓， 陈洪雷

(1温岭市中医院胸外科， 浙江 温岭 317500； 2武汉大学基础医学院病理学与病理生理学系，湖北 武汉 430071)

量子点免疫荧光技术检测EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在人肺癌组织中的表达意义*

潘 琦1， 陈福春1， 武百强1， 鲍 军1， 薛洁皓1， 陈洪雷2△

(1温岭市中医院胸外科， 浙江 温岭 317500；2武汉大学基础医学院病理学与病理生理学系，湖北 武汉 430071)

目的本研究利用新型免疫荧光标记试剂-量子点(QDs)结合组织芯片技术检测细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN/CD147)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和P53 蛋白在人肺癌组织中的表达，并探讨EMMPRIN与肺癌恶性生物学行为的关系。方法利用QDs免疫荧光组织化学(QDs-IHC)技术分别检测人肺癌组织芯片中EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白的表达，并利用QDs免疫荧光双标法同时检测了EMMPRIN与P53蛋白的共表达。结果EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白表达在肺癌组织的阳性率分别为：70.00%、77.14%和72.86%，与非癌变肺组织相比，差异均显著(P<0.05)；而且与肺癌的TNM分期、淋巴结转移均显著相关(P<0.05)，但与其它的临床病理特征均明显无关(P>0.05)。EMMPRIN和MMP-2、P53蛋白表达之间均呈显著正相关(P<0.01)。结论EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白均与肺癌的发生有关，EMMPRIN可能与MMP-2、P53协同促进肺癌的恶性进展。

肺肿瘤； 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子； 基质金属蛋白酶2； 量子点

量子点(quantum dots, QDs)或半导体纳米微晶体作为一种新型无机荧光染料，与传统的有机荧光染料相比，具有独特的光物理特性，目前已成为生物医学标记和光学成像的强有力工具。我们基于量子点的免疫荧光标记技术在石蜡包埋组织中能很好地检测不同抗原的表达，如可检测肿瘤的分子标志物等[1,2]。癌细胞的侵袭转移是促进肺癌恶性进展的重要因素，而细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分的降解是肺癌侵袭转移的必要步骤，能降解ECM的蛋白酶最主要的是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN/CD147)是个多功能蛋白，可诱导MMPs的产生而促进肿瘤细胞的侵袭和转移[3]。本研究采用量子点免疫荧光组织化学(QDs-immunofluorescence histochemistry, QDs-IHC)结合组织芯片技术检测EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在肺癌组织中表达和临床意义并探讨EMMPRIN与MMP-2、P53蛋白表达的关系。

材 料 和 方 法

1材料

1.1病人资料 收集我院存档的肺癌和非癌变肺组织蜡块共80例，由桂林泛谱生物技术有限公司协助构建160芯肺癌组织芯片，10×16点阵，每点直径1.1 mm，4 μm厚，其中包括70例肺癌组织，10例非癌变肺组织作为对照组，每例组织均有2点。所有组织术前均未经放、化疗治疗，经10%中性缓冲甲醛固定24 h。肺癌患者中男性57例，女性13例，年龄31-78岁，平均57岁。根据WHO(2004)肺肿瘤组织学分类法和国际抗癌联盟(UICC)2009年修订的P-TNM分期标准：鳞癌35例(高、中分化和低分化分别为：8例和27例)，腺癌28例包括5例支气管肺泡癌(高、中、低分化分别为：6例、16例和6例)，腺鳞癌4例，小细胞癌3例；TNM分期：ⅠA+ⅠB期37例，ⅡA+ⅡB期21例，ⅢA+ⅢB期12例。有淋巴结转移28例，无淋巴结转移42例。

1.2主要试剂 兔抗人EMMPRIN和MMP-2多克隆抗体(Zymed，工作浓度分别为1∶150、1∶100)，鼠抗人P53(sc-126)单克隆抗体(Santa Cruz，工作浓度为1∶100)；羊抗兔、鼠生物素化Ⅱ抗(Vector，工作浓度均为1∶400)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。量子点超敏荧光试剂盒(605 nm QD标记的链霉亲和素, QD 605 nm-SA)和量子点双染荧光试剂盒(QD 605 nm-SA+QD 545 nm-羊抗鼠IgG)均购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。

2方法

2.1QDs-IHC检测蛋白表达 实验方法参照文献[4]，组织芯片滴加90%甘油封片后，上荧光显微镜蓝光激发QD605，以细胞内出现红色的荧光颗粒为阳性。用TBS代替Ⅰ抗作空白对照，以已知阳性片作阳性对照。Olympus BX51(CCD DP72)荧光显微镜观察显示EMMPRIN蛋白定位于细胞膜和胞质内，MMP-2则定位于细胞胞质内，而P53则定位于胞核内。采用半定量评分方法，高倍镜下每芯选3-4个视野，每个视野计数100个细胞，首先将染色强度打分：0分为无色，1分为淡红色，2分为红色，3分为亮红色；再按阳性细胞所占百分比打分：阴性为0分，阳性细胞数1%-10%为1分，阳性细胞数11%-50%为2分，阳性细胞数51%-75%为3分；阳性细胞数>75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2为免疫荧光组织化学反应阳性。

2.2QDs免疫荧光双标法检测EMMPRIN和P53蛋白共表达 实验方法参照文献[2]， 简述如下：QD 605 nm-SA(工作浓度为1∶150)用以检测EMMPRIN蛋白表达，QD 545nm-羊抗鼠IgG 的混合物(工作浓度为1∶50)用以检测P53蛋白表达。90%缓冲甘油封片后，利用美国剑桥NuanceTM多光谱显微成像系统观察显示EMMPRIN蛋白定位于细胞膜和胞质内呈红色信号，而P53蛋白则定位于胞核内呈绿色信号，并统计EMMPRIN和P53蛋白的共表达例数。

3统计学处理

结 果

1EMMPRIN蛋白的表达意义

EMMPRIN蛋白主要表达在癌细胞的胞膜和胞质，而在癌旁正常组织中几乎不表达，而在肿瘤周围的间质细胞中有部分表达，见图1A、B。结果如表1、2所示，70例肺癌组织中EMMPRIN蛋白的阳性率为70.00%，与对照组相比差异显著(P<0.01)。EMMPRIN蛋白的阳性率与肺癌的年龄、性别、不同组织学类型和肺鳞癌、腺癌的病理分级之间无显著相关(P>0.05)，而与高TNM分期和伴有淋巴结转移呈显著正相关(P<0.05)。

2MMP-2蛋白的表达意义

MMP-2蛋白主要表达在癌细胞的胞质，而在癌旁正常组织中几乎不表达，而在成纤维细胞与内皮细胞中也有表达，见图1C、D。结果如表1和表2所示，70例肺癌组织中MMP-2蛋白的阳性率为77.14%，与对照组相比差异显著(P<0.01)。MMP-2蛋白的阳性率与肺癌的年龄、性别、不同组织学类型和肺鳞癌、腺癌的病理分级之间无显著相关(P>0.05)，而与TNM分期(P<0.01)和淋巴结转移均显著相关(P<0.05)。

3P53蛋白的表达意义

P53蛋白则定位于肺癌细胞的胞核内，但在支气管肺泡癌中几乎均为阴性表达，见图1E、F。结果如表1和表2所示，对照组和肺癌组中P53蛋白的阳性率分别为10.0%、72.86%，两组间差异显著(2=15.196,P<0.01)。P53蛋白表达阳性率在肺癌患者的不同年龄、性别、不同组织学类型和肺鳞癌、腺癌的病理分级之间差异均无显著(P>0.05)。P53蛋白与高TNM分期(P<0.05)和伴有淋巴结转移的肺癌呈显著正相关(P<0.01)。

4EMMPRIN与MMP-2、P53蛋白表达之间的相关性

结果如表3所示，70例肺癌组织中，EMMPRIN和MMP-2蛋白共同阳性表达44例，共同阴性表达11例，二者呈显著正相关(P<0.01,r=0.460)；EMMPRIN和P53蛋白共同阳性表达42例，见图2，共同阴性表达12例，二者呈显著正相关(P<0.01,r=0.442)。

表1 EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在肺癌中的表达及其临床病理意义

SCC:squamous cell carcinoma; AC:adenocarcinoma; ASC:adenosquamous carcinoma; SCLC:small cell lung cancer.

表2EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白表达与肺鳞癌、腺癌分级的关系

Table 2. Relationship between expression of EMMPRIN, MMP-2 and P53 proteins and grade of lung squamous cell carcinomas and adenocarcinomas

ParametersnEMMPRINPMMP-2PP53P﹣﹢﹣﹢﹣﹢Squamouscellcarcinoma35>0．05>0．05>0．05Well，moderatelydifferentiated8533544Poorlydifferentiated27720423720Adenocarcinoma28>0．05>0．05>0．05Welldifferentiated6242433Moderatelydifferentiated16511511313Poorlydifferentiated6061506

Figure 1. Expression of EMMPRIN, MMP-2 and P53 proteins detected by QDs-IHC in lung cancer (blue light excitation)A,B: positive expression of EMMPRIN protein in lung squamous cell carcinoma (A, ×100; B, ×200);C,D: positive expression of MMP-2 protein in lung squamous cell carcinoma(C, ×100; D, ×200);E,F: positive expression of P53 protein in lung adenocarcinoma (E, ×100; F, ×200).

图1QDs-IHC检测肺癌组织中EMMPRIN、MMP-2和P53的蛋白表达

表3肺癌组织中EMMPRIN与MMP-2、P53蛋白表达之间的关系

Table 3. Relationship between co-expression of EMMPRIN and MMP-2, P53 proteins in the lung cancer tissues

ParametersnEMMPRINrP﹣﹢P530．442<0．01﹣19127﹢51942MMP-20．460<0．01﹣16115﹢541044

讨 论

蛋白的免疫标记技术在肿瘤标志物的检测中已得到广泛地使用。由于QDs具有很宽的激发光谱，单一波长激发光可激发QDs的多色荧光，因此可以用于多组分分子的同时检测；并且发光强度大，荧光寿命长，光稳定性好[2]，能与特异的靶分子相互作用，基于QDs的免疫标记比传统方法更敏感，特别对于一些低表达基因的检测。如Chen等[5]报道在乳腺癌的研究中利用QDs的荧光标记检测Her-2蛋白的表达比传统的IHC法更好。而本研究中采用QDs-IHC 技术检测肺癌组织芯片中EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白的表达，定位准确，并能长时间观察荧光信号，没有瘁灭现象，而且还能在同一标本上同时检测2种不同定位的抗原，表明QDs-IHC 能精确检测肺癌组织上的不同蛋白表达。

EMMPRIN最早从肺癌细胞系LX - 1中被分离出来，是一类属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在人体内广泛分布，具有多种不同的功能，而它在肿瘤的生长、浸润和转移中的作用是目前研究的热点之一。EMMPRIN不仅参与细胞与细胞或细胞与基质的黏附，而且可通过肿瘤细胞周围间质的成纤维细胞刺激合成MMPs，能够降解ECM，促进肿瘤的浸润与转移[6]。本研究显示，EMMPRIN蛋白在肺癌组织中的阳性表达率显著高于对照组，表明在肺癌的恶性进展中，EMMPRIN起很重要作用。EMMPRIN蛋白的阳性率与肺癌患者的性别、年龄、不同组织学类型和病理分级之间无显著相关，但与高TNM分期和伴有淋巴结转移的肺癌均呈显著正相关，表明EMMPRIN蛋白表达的升高有助于肺癌的侵袭转移。Sienel等[3]研究150例肺原发肿瘤中发现，EMMPRIN定位于胞膜与肺腺癌生存期缩短相关，但Hakuma等[7]在208例外科切除的非小细胞肺癌组织中研究发现EMMPRIN表达的阳性率为92%，与低TNM分期和高分化腺癌相关，而与非小细胞肺癌的预后无关。

Figure 2. Co-expression of EMMPRIN and P53 proteins in the lung cancer analyzed by CRi multispectral imaging system (blue light excitation.red:EMMPRIN; green:P53.×400)A: positive signal of EMMPRIN and P53 proteins (RGB color);B: emission spectrum of 545 nm(green), 605 nm(red)quantum dots and background (black);C: red positive signal of EMMPRIN protein splited by spectrum;D: green positive signal of P53 protein splited by spectrum;E: autofluorescence signal of background;F: unmixed composite image of co-expression signal of EMMPRIN and P53 proteins generated by CRi imaging system.

图2量子点免疫荧光双标法检测肺癌中EMMPRIN和P53蛋白的共表达

MMP-2是一种锌离子依赖的蛋白水解酶，分子量为72 kD。MMP-2以酶原形式分泌，不具有酶活性，I型膜型MMP(membrance type 1 MMP, MT1-MMP)等可将其激活，被激活后的MMP-2能水解细胞基底膜及ECM 中的Ⅳ型、V型胶原和纤维连接蛋白成分，导致基底膜破坏，肿瘤细胞浸润结缔组织基质，侵入小血管和淋巴管而发生转移。关于MMP-2与肿瘤侵袭、转移的关系国内外作了大量的实验研究，Guo等[8]研究认为MMP-2是一个与肺癌的进展、转移和生存相关的敏感指标。本研究显示，MMP-2蛋白在非癌变肺组织中几乎不表达，而在成纤维细胞与内皮细胞中有表达，肺癌组织中MMP-2蛋白的阳性率与对照组相比差异显著，表明MMP-2的表达与肺癌的发生有关。MMP-2蛋白的阳性率与高的TNM分期和伴有淋巴结转移呈显著正相关，而与其它的临床病理参数均无关，以上这些均可提示MMP-2蛋白阳性表达与肺癌的侵袭转移密切相关。然而在70例肺癌组织中，EMMPRIN 和MMP-2蛋白表达之间呈显著正相关，提示彼此可能协同促进肺癌的侵袭转移，与Leinonen等[9]的文献报道一致。但Sienel等[3]研究并未发现肺癌中EMMPRIN与MMP-2蛋白表达之间显著相关。

抑癌基因p53参与细胞增殖和分化的调控，其主要生物学功能是引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡和促进细胞分化。但p53基因也是人类肿瘤最常见的突变或缺失基因，突变后丧失了正常p53基因的功能，而且自身获得了癌基因的功能，将导致肿瘤的发生。由于野生型P53蛋白的半衰期短，用免疫组化方法不易检出，而突变型P53蛋白抑癌功能丧失，致癌功能激活，半衰期大大延长，含量高出正常100-1 000倍，且能与一些癌蛋白形成稳定的复合物，易于被免疫组化检测到，且p53突变和P53蛋白在组织中的表达是一致的[10]。本研究采用QDs-IHC检测肺癌组织中P53蛋白的阳性表达率显著高于非癌变肺组织，提示P53与肺癌的发生密切相关。本研究发现P53蛋白表达阳性率与TNM分期上升以及伴有淋巴结转移均显著相关，表明P53蛋白表达与肺癌TNM分期相关；p53突变的肺癌更容易发生淋巴结转移。但本研究并未发现P53蛋白表达与其它临床病理特征有关。另外文献报道，p53突变还与非小细胞肺癌的复发显著相关[11]。

关于EMMPRIN 与P53在肺癌组织中的研究国内外鲜见相关报道。本研究利用量子点免疫荧光双标技术同时检测肺癌组织中EMMPRIN 与P53蛋白的共表达，结果表明，在同一波长激发光下能清晰显示这两种蛋白在同一细胞内的定位，但少数区域两种信号有所重叠，故本研究还采用美国剑桥NuanceTM多光谱成像分离技术，把两种信号先采集再分开，最后模拟成像，效果很好，还能定量分析。本研究中发现EMMPRIN 与P53蛋白的共表达情况：EMMPRIN和P53蛋白共同阳性表达42例，共同阴性表达12例，二者呈显著正相关(P<0.01,r=0.442)，表明在肺癌的进展中，EMMPRIN 与P53可能互相协同促进。

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ProteinexpressionofEMMPRIN,MMP-2andP53detectedbytechniqueofquantumdotsimmunofluorescenceinhumanlungcancer

PAN Qi1, CHEN Fu-chun1, WU Bai-qiang1, BAO Jun1, XUE Jie-hao1, CHEN Hong-lei2

(1DepartmentofThoracosurgery,TraditionalChineseMedicalHospitalofWenling,Wenling317500,China;2DepartmentofPathologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalScience,WuhanUniversity,Wuhan430071,China.E-mail:chenhongleiwh@126.com)

AIM: To investigate the expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN/CD147), matrix metalloproteinase2 (MMP-2) and P53 proteins in human lung cancer tissues and to explore the relationship between EMMPRIN protein and malignant biological behaviour of lung cancer.METHODSFluorescent semiconductor nanocrystals [also known as quantum dots (QDs)] were applied, which were nanometer-sized light-emitting particles and were emerging as a new class of fluorescent probes for cancer detection due to the unique optical and electronic properties. The technique of QDs immunofluorescence histochemistry (QDs-IHC) was used to detect the protein expression of EMMPRIN, P53 and MMP-2 in the human lung cancer microarray, and co-expression of EMMPRIN/P53 proteins was also simultaneously detected by double-labeling immunofluorescence.RESULTSCompared with non-cancerous lung tissues, the positive rates of EMMPRIN, P53 and MMP-2 proteins in the lung cancer tissues were 70.00%, 77.14% and 72.86%, respectively, and the differences were all significant (P<0.05). The positive rates of EMMPRIN, P53 and MMP-2 proteins were all significantly related with tumor staging(TNM stage) and lymph node metastasis (P<0.05). The positive correlation between EMMPRIN expression and protein levels of MMP-2 and P53 was observed (P<0.01).CONCLUSIONThe protein expression of EMMPRIN, P53 and MMP-2 is correlated with the development of lung cancer. Malignant progression of lung cancer promoted by EMMPRIN may be closely related with the expression of MMP-2 and P53.

Lung neoplasmas; Extracellular matrix metalloproteinase inducer; Matrix metallopreteinase 2; Quantum dots

R734.2

A

1000-4718(2011)03-0488-06

2010-09-09

2010-11-30

国家自然科学基金资助项目(No.30900652) ；浙江省中医药普通课题研究计划资助项目(No. 2008CB077)

△通讯作者 Tel：0576-86207747; E-mail:chenhongleiwh@126.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.013