纺锤体组装检测点基因BubR1的研究进展

陈曌君，李 锋，杨 军 综述

(1.浙江大学公共卫生学院毒理系，浙江 杭州 310058;2.山西省侯马市人民医院，山西 侯马 043000)

上世纪90年代初期，研究人员在酵母基因筛查试验中找到一系列与纺锤体检测点调控有关的基因，并证实这些基因在高等动物中高度保守，其编码的蛋白是纺锤体检测点(spindle assembly checkpoint，SAC)的重要组成成分［1-2］。SAC成员主要包括Mad1(mitotic arrestdeficient 1)、Mad2，Bub1(budding uninhibited by benzimidazoles 1)、Bub3，BubR1(Bub-related 1)，Msp1(monopolar spindle 1)，Aurora B 等蛋白［3］。其中，BubR1是 SAC中的重要组分，在调控SAC的监测机制中起着重要的作用。近来有研究表明，BubR1不但参与监测有丝分裂过程中微管与着丝点的结合，还在细胞减数分裂过程、DNA损伤应答、肿瘤、不孕和衰老［4-7］等方面起到重要的调控作用。现将纺锤体检测点蛋白BubR1的功能及研究现状做一综述。

1 BubR1在纺锤体检测点中的作用

纺锤体检测点又称有丝分裂检测点，在监测染色体的正常分离及阻止非整倍体形成的过程中起到重要的作用。在细胞有丝分裂中期，只有当染色体全部正确地与来自纺锤体两极的微管结合并排列到赤道板上，有丝分裂后期促进因子(anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C)才能与其活化因子Cdc20结合，并通过泛素化其底物(如CyclinB1、Securin)使细胞进入有丝分裂后期［8］。否则，SAC这一检测通路将会被激活，从而阻止细胞由分裂中期进入后期。

1.1 BubR1在有丝分裂SAC中的作用 在有丝分裂中，BubR1主要是感受姐妹染色单体上着丝点间的张力［9］以及着丝粒相关蛋白 E(centromere associated protein-E，CENP-E)共同监测着丝点上微管的附着状态［10］。一旦着丝点与微管未连接或着丝点间的张力不平衡将导致SAC监测机制的激活［8］。SAC被激活后，BubR1借助其结构上所具有的不依赖Mad2的Cdc20结合位点与Cdc20蛋白结合并抑制其活性［11-12］。另外，BubR1也可通过Mad2与Cdc20结合，形成Bub3-BubR1-Cdc20复合体从而抑制APC/C 的活性［13-14］;同时研究显示，BubR1 先于Mad2与Cdc20结合，且对APC/C的抑制能力更强［15］。BubR1还可与Bub3、Mad2 和Cdc20形成有丝分裂检测点复合物(mitotic checkpoint complex，MCC)四聚体，抑制 APC/C的活性［16-17］，从而阻止细胞进入有丝分裂后期。只有当所有的纺锤体微管与着丝点正确连接，产生适当的张力，SAC监测机制关闭，Cdc20被释放，细胞才能进入有丝分裂后期［4］。

BubR1基因的缺失将导致SAC的妥协反应［18］。研究表明，BubR1基因缺失的细胞能够逃逸微管解聚剂——诺考达唑(nocodazole)引起的有丝分裂阻滞而进入分裂后期，造成细胞具有异常的染色体数目，即非整倍体。BubR1在SAC上的作用存在一定的剂量依赖效应。Bohers等［19］人的实验表明:在有丝分裂过程中，细胞经纺锤体干扰物——秋水仙碱(colchicine)处理后所引起细胞阻滞的比例与细胞中BubR1的表达水平呈正相关;且BubR1减少将引起染色体的超前分离(premature chromatid separation，PCS)，当 BubR1 的水平低于50%时，非整倍体的数量明显增加。因此，BubR1的作用与其数量有关，且影响着非整倍体的产生。

1.2 BubR1在减数分裂SAC中的作用 在减数分裂与有丝分裂过程中SAC的不同之处仅仅在于减数分裂I期染色体间所产生的张力是来自于同源染色体而非姐妹染色单体。当同源染色体上的着丝点与微管没有正确的连接或是在同源染色体间产生不适当的张力，就会激活SAC，使细胞停滞于前中期。在减数分裂II期，染色体与微管的连接、SAC的激活等均与有丝分裂相一致［20］。Wei［4］等人研究表明:BubR1基因缺失的卵母细胞经nocodazole处理后，能逃逸SAC依赖的细胞周期停滞;BubR1的过度表达会使细胞停滞在第一次减数分裂中期的时间延长;而BubR1表达不足则会加速细胞减数分裂的过程。这些结果揭示了BubR1是第一次减数分裂中期SAC所必需的，这可能是由于BubR1表达增加/不足引起纺锤体检测点信号增强/减弱，从而延长/缩短了减数分裂的时间，符合“检测点信号增强”假说。

2 BubR1参与DNA损伤应答调控

当细胞进入有丝分裂期后遇到DNA损伤，通过启动“自杀”或者激活SAC来延缓细胞有丝分裂的过程，给细胞足够时间将错误予以修复，从而来维持基因的完整性。在酵母、果蝇或是哺乳动物细胞［21-23］中SAC都能通过停滞有丝分裂的过程来应答DNA损伤，而BubR1作为SAC蛋白，在此过程中起着重要的作用。Hyunsook和Lee等［24-25］报道了经阿霉素(一种抗肿瘤药物)处理细胞产生双链断裂(double strand breaks，DSBs)后，大量的 BubR1结合到着丝点上，其磷酸化的时间延长，与对照组相比有丝分裂过程延迟9 h，这可能是由于DSBs改变了染色体的拓扑结构，从而影响了着丝点-微管粘附的状态，引发了BubR1对此产生的一系列应答反应。另外，在酵母［24］、BRCA2缺失细胞［25］等研究表明 DNA损伤检验点(DNA damage checkpoint，DDC)与 SAC在 DNA 损伤修复中起着协同作用，而BubR1可能是介导这两条通路交叉应答(cross-talk)上的重要因子。Dai［5］等人也证实了这一结论:经阿霉素和紫外线诱导的BubR1+/-MEFs细胞DNA受损后，引起有丝分裂停滞，同时伴随着γH2AX、p53、p21、PARP-1蛋白表达水平的降低。

3 BubR1的磷酸化

细胞内BubR1蛋白的数量与其功能相关，且共价修饰尤其是磷酸化修饰在其功能的调控上也起着重要的作用。研究表明，BubR1作为Plk1激酶的底物，能被Plk1磷酸化，磷酸化后的BubR1对维持着丝点-微管连接的稳定性起着重要的作用，但不是其与SAC或APC/C连接所必须的［26-28］。Elowe 等［26］人研究表明，削弱BubR1与Plk1之间的关联，会使BubR1磷酸化缺失，最终导致着丝点-微管稳定性的降低。而且，BubR1的S676位点磷酸化对着丝点张力敏感。当染色体排列在赤道板上即姐妹染色体着丝粒上形成张力时，S676位点上的磷酸化消失;当再次用紫杉醇短暂处理后，pS676又会快速地出现。另外，Wong等［29］在非洲蟾蜍卵提取物的研究中发现，BubR1作为Plk1的底物，磷酸化后产生的3F3/2磷酸化表位在SAC中有一定的作用。然而，Timothy［10］等在BubR1上找到4个有丝分裂特有的磷酸化位点，这些位点不能够被Plk1和Aurora B激酶磷酸化，且BubR1基因S670位点和S1034位点上的磷酸化对着丝点与微管间连接的缺失高度敏感，而对着丝点上的张力不敏感［10］，与之前Elowe等人证实的pS676位点对着丝点张力敏感的结论刚好相反［26］。这可能是BubR1磷酸化的位置是由微管粘附的状态和着丝点上的张力所决定的。另外，还有研究报道［15］BubR1的磷酸化和乙酰化是BubR1由APC/C复合物的抑制剂转变为APC/C底物的过程。

4 BubR1在肿瘤形成、不孕、衰老中的作用

由于BubR1对染色体的分离有特殊检测功能，近来越来越多有关肿瘤方面的研究聚焦在BubR1这个重要的因子上。许多研究［30-31］表明，BubR1基因的缺失或半缺失(haploinsufficiency)导致染色体不稳定，最终触发肿瘤的形成，如肺癌、结直肠癌。Kakeji等［6］报道50.3%的胃癌患者BubR1蛋白表达水平明显增加，而且BubR1蛋白表达水平与DNA非整倍体间存在显著的关联性;BubR1高表达的患者常伴有肿瘤的深度浸润，以及生存率的降低。这可能是由于BubR1的过度表达导致MCC的减少，从而致使SAC监测能力下降，让染色体不稳定的细胞逃避监测后直接进入有丝分裂后期，最终造成DNA非整倍体的产生。

在肿瘤治疗中，常利用抗癌药物诱导基因损伤，激活细胞周期检测点信号传导通路，使细胞分裂停滞或者诱导其凋亡。然而，有许多因素可造成肿瘤对化学药物的治疗效果不佳，其中检测点成分(如BubR1)表达异常所致的检测点功能失常就是重要的原因之一［32］。因此，BubR1在肿瘤治疗中倍受关注。

此外，BubR1蛋白表达水平与机体的不孕、衰老等有着密切的关系［7］。研究表明［33］:BubR1－/－大鼠的胚胎不能正常发育;BubR1－/H大鼠(表达BubR1蛋白水平的量是野生型的4%)的胚胎虽然能够发育至出生，但出生后只能存活数小时。Baker等［34］人观察到BubR1H/H的大鼠出生时生长状态良好，但出生2～3个月就会表现出一些异常症状，如:双侧白内障、真皮和皮下脂肪减少、恶病质、损伤修复能力下降、生命周期减短等衰老的症状。4个月大的BubR1H/H大鼠的精子量是野生型大鼠的1/4;体外受精实验(BubR1H/H大鼠的精子和野生型大鼠的卵子结合)表明受精后的卵子发育为正常胚胎的数量明显减少，仅为正常大鼠受孕后胚胎数的1/13。

5 展望

目前，虽然BubR1的功能及其作用机制已较为明确，但大部分仅限于体外实验或动物实验，特别是在肿瘤的形成和治疗上，仍有许多细节亟待解决。因此，对BubR1基因结构、功能以及它与其他相关因子间相互作用等的深入研究，势必有益于进一步阐明BubR1与肿瘤、不孕、衰老等相关疾病的联系，从而为解决这些困扰人类已久的问题提供新的思路。

［1］HOYT M A，TOTIS L，ROBERTS B T S.Cerevisiae genes required for cell cycle arrest in response to loss of microtubule function ［J］.Cell，1991，66(3):507-517.

［2］WEISS E，WINEY M.The Saccharomyces cerevisiae spindle pole body duplication gene MPS1 is part of a mitotic checkpoint［J］.J Cell Biol，1996，132(1-2):111-123.

［3］CAHILL D P，LENGAUER C，YU J，et.al Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers［J］.Nature，1998，392(6673):300-303.

［4］WEI L，LIANG X W，ZHANG Q H，et al.BubR1 is a spindle assembly checkpoint protein regulating meiotic cell cycle progression of mouse oocyte［J］.Cell Cycle，9(6):1112-1121.

［5］FANG Y，LIU T，WANG X，et al.BubR1 is involved in regulation of DNA damage responses ［J］.Oncogene，2006，25(25):3598-3605.

［6］ANDO K，KAKEJI Y，KITAO H，et al.High expression of BUBR1 is one of the factors for inducing DNA aneuploidy and progression in gastric cancer［J］.Cancer Sci，101(3):639-645.

［7］KIM M，KAO G D.Newly identified roles for an old guardian:profound deficiency of the mitotic spindle checkpoint protein BubR1 leads to early aging and infertility［J］.Cancer Biol Ther，2005，4(2):164-165.

［8］LI M，FANG X，WEI Z，YORK J P，et al.Loss of spindle assembly checkpoint-mediated inhibition of Cdc20 promotes tumorigenesis in mice ［J］.J Cell Biol，2009，185(6):983-994.

［9］SKOUFIAS D A，ANDREASSEN P R，LACROIX F B，etal.Mammalianmad2 andbub1/bubR1 recognize distinct spindle-attachment and kinetochore-tension checkpoints［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(8):4492-4497.

［10］HUANG H，HITTLE J，ZAPPACOSTA F，et al.Phosphorylation sitesin BubR1 thatregulate kinetochore attachment，tension，and mitotic exit［J］.J Cell Biol，2008，183(4):667-680.

［11］SCZANIECKA M，FEOKTISTOVA A，MAY K M，et al.The spindle checkpoint functions of Mad3 and Mad2 depend on a Mad3 KEN box-mediated interaction with Cdc20-anaphase-promoting complex(APC/C)［J］.J Biol Chem，2008，283(34):23039-23047.

［12］DAVENPORT J，HARRIS L D，GOORHA R.Spindle checkpoint function requires Mad2-dependent Cdc20 binding to the Mad3 homology domain of BubR1 ［J］.Exp Cell Res，2006，312(10):1831-1842.

［13］NILSSON J，YEKEZARE M，MINSHULL J，et al.The APC/C maintainsthe spindle assembly checkpoint by targeting Cdc20 for destruction［J］.Nat Cell Biol，2008，10(12):1411-1420.

［14］ZHANG J，AHMAD S，MAO Y.BubR1 and APC/EB1 cooperate to maintain metaphase chromosome alignment［J］.J Cell Biol，2007，178(5):773-784.

［15］CHOI E，CHOE H，MIN J，et al.BubR1 acetylation at prometaphase is required for modulating APC/C activity and timing of mitosis［J］.Embo J，2009，28(14):2077-2089.

［16］YU H.Regulation of APC-Cdc20 by the spindle checkpoint［J］.Curr Opin Cell Biol，2002，14(6):706-714.

［17］CHAN G K，YEN T J.The mitotic checkpoint:a signaling pathway that allows a single unattached kinetochore to inhibit mitotic exit［J］.Prog Cell Cycle Res，2003，5(431-439.

［18］RAO C V，YAMADA H Y，YAO Y，et al.Enhanced genomic instabilities caused by deregulated microtubule dynamics and chromosome segregation:a perspective from genetic studies in mice ［J］.Carcinogenesis，2009，30(9):1469-1474.

［19］BOHERS E，SARAFAN-VASSEUR N，DROUET A，et al.Gradual reduction of BUBR1 protein levels results in premature sister-chromatid separation then in aneuploidy ［J］.Hum Genet，2008，124(5):473-478.

［20］TAYLOR S S，SCOTT M I，HOLLAND A J.The spindle checkpoint:a quality control mechanism which ensures accurate chromosome segregation［J］.Chromosome Res，2004，12(6):599-616.

［21］GARBER P M，RINE J.Overlapping roles of the spindle assembly and DNA damage checkpoints in the cell-cycle response to altered chromosomes in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Genetics，2002，161(2):521-534.

［22］ROYOUA，MACIASH，SULLIVANW.The Drosophila Grp/Chk1 DNA damage checkpoint controls entry into anaphase ［J］.Curr Biol，2005，15(4):334-339.

［23］NITTA M，KOBAYASHI O，HONDA S，et al.Spindle checkpoint function is required for mitotic catastropheinduced byDNA-damagingagents［J］.Oncogene，2004，23(39):6548-6558.

［24］MYUNG K，SMITH S，KOLODNER R D .Mitotic checkpoint function in the formation of gross chromosomalrearrangements in Saccharomyces cerevisiae［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(45):15980-15985.

［25］LEE H，TRAINER A H，FRIEDMAN L S，et al.Mitotic checkpoint inactivation fosters transformation in cells lacking the breast cancer susceptibility gene，Brca2 ［J］.Mol Cell，1999，4(1):1-10.

［26］ELOWE S，HUMMER S，ULDSCHMID A，et al.A Tension-sensitive Plk1 phosphorylation on BubR1 regulates the stability of kinetochore microtubule interactions［J］.Genes Dev，2007，21(17):2205-2219.

［27］LENART P，PETRONCZKI M，STEEGMAIER M，et al.The small-molecule inhibitor BI 2536 reveals novel insights into mitotic roles of polo-like kinase 1 ［J］.Curr Biol，2007，17(4):304-315.

［28］MATSUMURA S，TOYOSHIMA F，NISHIDA E.Polo-like kinase 1 facilitates chromosome alignment during prometaphase through BubR1 ［J］.J Biol Chem，2007，282(20):15217-15227.

［29］WONG O K，FANG G.Cdk1 phosphorylation of BubR1 controls spindle checkpoint arrest and Plk1-mediated formation of the 3F3/2 epitope［J］.J Cell Biol，2007，179(4):611-617.

［30］DAI W，WANG Q，LIU T，et al.Slippage of mitotic arrest and enhanced tumor development in mice with BubR1 haploinsufficiency ［J］.Cancer Res，2004，64(2):440-445.

［31］RAO C V，YANG Y M，SWAMY M V，et al.Colonic tumorigenesis in BubR1+/-ApcMin/+compound mutant mice is linked to premature separation ofsisterchromatidsand enhanced genomic instability ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(12):4365-4370.

［32］VOGEL C，HAGER C，BASTIANS H.Mechanisms of mitotic cell death induced by chemotherapymediated G2 checkpoint abrogation ［J］.Cancer Res，2007，67(1):339-345.

［33］WANGQ，LIUT，FANGY，etal.BUBR1 deficiency results in abnormal megakaryopoiesis［J］.Blood，2004，103(4):1278-1285.

［34］BAKER D J，JEGANATHAN K B，CAMERON J D，et al.BubR1 insufficiency causes early onset of aging-associated phenotypes and infertility in mice［J］.Nat Genet，2004，36(7):744-749.