NMDA受体依赖的神经元存活及保护作用的机制

杜 嵩，罗建红，邱 爽 综 述

NMDA受体依赖的神经元存活及保护作用的机制

杜 嵩，罗建红，邱 爽 综 述

(浙江大学医学院神经生物系、卫生部医学神经生物学重点实验室，浙江杭州310058)

NMDA受体属于谷氨酸受体，它在突触传递和突触可塑性中都发挥着非常重要的作用，其介导的兴奋性毒性是脑缺血、缺氧和脑外伤等导致脑损伤的重要分子机制。但是，近年来的研究发现，在生理和某些病理情况下，NMDA受体的激活具有促进神经元存活及保护神经元免受损伤的作用。

脑损伤/药物疗法;神经元/药物作用;突触传递;NMDA受体;存活;机制

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(4):440-445.］

NMDA受体属于谷氨酸受体，是中枢神经系统中非常重要的兴奋性神经递质受体。NMDA受体有三个编码基因，分别编码NR1、NR2、NR3 亚单位［1］。NR1 亚单位有一个甘氨酸结合位点，对于形成功能性受体是必需的，没有该亚单位的表达，新生小鼠会由于呼吸衰竭而在出生后几小时内死亡。NR1亚单位有8种剪切变体，可由NR1编码基因的3个外显子重排组合而成，几乎全脑表达。NR2亚单位包括4个亚型(NR2A-D)。该亚单位有一个谷氨酸结合位点，具有调节受体活动的功能。该亚单位的表达具有区域性和时间特异性，NR2B和NR2D在胚胎时期全脑组织广泛表达，而NR2A和NR2C分别在成年后的脑干和小脑组织表达，在NMDA受体复合物中，NR2决定了通道的导电性和动力学特性以及对药物的敏感性［2］。NR3由NR3A和 NR3B两个亚型组成，还待进一步研究其生理学意义和药理学功能。NMDA受体对钙离子有很高的通透性。当它被激活时，可以产生钙内流，从而激活一系列的下游信号因子，参与神经细胞之间的信号传递。但是在某些病理情况下，如缺血缺氧、脑外伤等，谷氨酸大量释放，大量的Ca2+进入神经元导致钙超载，最终使神经元变性坏死，出现病理情况下的神经系统功能缺失或减退［3］。因此，NMDA受体一直是人们试图有效治疗脑中风、脑外伤等疾病的关键靶点。可让人困惑的是，NMDA受体的拮抗剂并没有起到很好的临床疗效，虽然这其中有很多种因素，例如治疗的时机，药物的选择性等等，但是，有一点是不容忽视的，那就是越来越多的研究提示，生理水平NMDA受体活性是有神经保护作用的［4］，并且在某些病理条件下，NMDA受体的激活也具有保护神经元免受损伤的作用。这为重新认识NMDA受体的多面性提供了新的视角，正如Feng认为的那样，川剧中的变脸是自然界中最艺术的生命法则［5］。文中，先简要总结NMDA受体介导的兴奋性毒性的分子机制，然后重点概括近20年来，人们对NMDA受体依赖的神经元存活及神经元保护作用机制的研究进展。

1 NMDA受体介导的兴奋性毒性及分子机制

NMDA受体属于离子型谷氨酸受体，当它被激活时，除了对Na+、K+具有通透性之外，NMDA受体主要负责Ca2+的内流。Ca2+是神经元信号传递的第二信使，它介导了NMDA受体的很多生理功能。但是，在病理状态下，比如脑损伤，低氧或者缺血损伤等，神经元处于周围谷氨酸水平较高的环境中，导致NMDA受体被大量激活，使得过多Ca2+内流，产生钙超载，引起神经元的凋亡或者死亡［6］。

目前，关于NMDA受体介导的兴奋毒性的信号通路已经研究的比较透彻。例如，它可以通过激活GSK3β引起细胞凋亡。GSK3β可以激活PP1并抑制CREB产生兴奋毒性。有研究发现，GSK3β的Ser9位点的磷酸化可以抑制其活性［7］。在神经元存活通路中涉及到的 Akt、PKA、PKC和EKR1/2，可以通过磷酸化GSK3β的Ser9位点来抑制其活性，GSK3β的激活可以导致细胞凋亡，抑制其活性可减轻凋亡的发生。NMDA受体过度激活，还可以通过nNOS通路引起神经元的凋亡或死亡。nNOS系统被激活后可以产生氧化应激，激活下游的 JNK和PARP分子，导致线粒体的功能紊乱和去极化作用增强。这些都是线粒体释放凋亡因子的因素，然后发生一系列的凋亡后续反应，导致神经元死亡。Calpain通路的激活则是NMDA受体产生兴奋性毒性的另一条通路。NMDA受体的过渡激活使Calpain激活，导致mGluR1α的分解，抑制Akt活性，使得线粒体加速释放凋亡因子进而促进凋亡。

2 参与NMDA受体促进神经存活及神经保护作用的信号通路

NMDA受体的神经保护作用最初是在1994年被研究发现的。Gould小组发现，出生1周之内的大鼠，如果在体阻断NMDA受体的活性，可以导致健康的海马神经元数目的下降［8］。随后，陆续有文章报道，发育早期，阻断NMDA受体的活性可以导致很广泛的凋亡，并增强缺血缺氧所造成的脑损伤［9-11］。更有意思的是，在成年的中枢神经系统，如果在缺血性脑损伤之后给予阻断NMDA受体，那么可以加速神经元的丢失［12］，并抑制海马齿状回新生神经元的存活［13］。

为了能够更有效地研究NMDA受体介导神经保护作用的信号通路，人们开始尝试建立细胞模型。最初，这些细胞模型主要是建立在用不同浓度的谷氨酸来处理小脑颗粒细胞基础之上的［14］。但是，这大多都是一种非生理的情况，并且细胞外孵育谷氨酸可以同时激活突触内和突触外的NMDA受体，并不是非常理想的细胞模型。随后，英国的Bading小组和之后的Hardingham小组建立了一种全新的体外NMDA受体神经保护的细胞模型［15-16］。他们发现，如果对神经元，包括海马神经元和皮层神经元，进行饥饿处理，会导致神经元的凋亡。但是，如果同时给予GABA受体的拮抗剂来提高神经元的突触前递质释放，激活突触后受体，可以逆转饥饿所导致的神经元死亡，并且这个过程是NMDA受体依赖的。这一模型的建立极大地推动了NMDA受体神经保护作用分子机制的研究。下面总结NMDA受体参与神经保护功能的几条信号通路。

2.1 PI3K/Akt信号通路 PI3/Akt也称蛋白激酶B(PKB)，是级联反应信号途径中的重要分子。在培养的小脑颗粒细胞，皮层神经元和大鼠海马神经元的细胞模型中发现，当NMDA受体激活后，Ca2+入胞，以 Ca2+/camodulin的方式激活PI3K。该酶细胞膜上的PtdIns(4-5)P2催化为PtdIns(3-5)，并征募PDK1以及它的底物 Akt到细胞膜上，通过 PH(pleckstrin homology)结构域与PtdIns(3-5)P3相互作用。PDK1和PDK2一起磷酸化并激活Akt，而后，Akt通过磷酸化失活GSK3β(glycogen synthase kinase 3β)来提高神经元存活和生长。该通路对于NMDA受体的信号转导来说具有神经保护作用［17］。NMDA受体在生理水平被激活时可以产生激活Akt通路的生物学效应，但是过度激活NMDA受体不但不能激活Akt通路的神经保护作用，还会抑制Akt通路的作用导致神经兴奋毒性的加重。Akt不但参与NMDA受体激活的神经保护作用，它还参与了抗凋亡作用，如使BAD(Bcl2/Bcl-XL-antagonist引起细胞死亡)磷酸化后失活，中止与其家族成员Bcl-2和Bcl-XL的相互作用;另外，JNK(c-Jun N-terminal kinase)/p38激活剂ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)也可以被Akt的磷酸化所抑制［9，17］。

2.2 ERK信号通路 细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)是真核细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的家族成员，在神经元保护作用通路上起到重要的作用。研究发现，培养的大鼠皮层神经元或小脑颗粒细胞，缺血缺氧预处理后，NMDA受体可以通过介导ERK1/2通路产生抗神经元凋亡的作用，如果阻断 ERK1/2，则可以完全消除NMDA受体对神经元的保护作用。另外，在氧糖剥夺的大鼠皮层神经元细胞模型中也发现，缺血缺氧导致 NMDA受体激活，后者增加BDNF的释放，BDNF进一步激活 ERK1/2，发挥神经保护作用。如果在此模型下注入NMDA受体拮抗剂，可以使ERK1/2的活性降低，破坏NMDA受体的神经保护作用。

2.3 Ca2+/Calmodulin依赖的激酶前存活信号途径 虽然细胞外钙离子的过多内流是造成神经元损伤的关键因素，但是，Ca2+/Calmodulin依赖的激酶如 CaMKK和 CaMKs，却参与了NMDA受体介导的神经保护作用。研究发现，CaMKII和 CaMKIV 两个激酶的抑制剂［18］，例如KN62，可以阻断该通路的保护作用。Calmodulin抑制剂W13也有类似的功能。在NG108神经胶质细胞中，撤除血清诱导的神经元凋亡，可以由NMDA介导产生保护作用;但是，由于CaMK的激酶(CaMKK)显性激活突变体形式，可以抑制NMDA产生的保护作用［19］。CaMKK神经元保护作用的机制在于，它可以直接磷酸化和激活蛋白激酶Akt。我们在上文中，已经提及Akt的神经保护作用机制［20］。

2.4 CREB通路和 NF-kB通路 转录因子CREB是一个重要的活性依赖的基因表达介导因子，CREB转录因子的Ser133位点磷酸化可以征募CBP，当与CRE结合后，可以诱导CRE依赖的基因表达。Hardingham和他的同事发现［21］，在大鼠皮层神经元中，突触NMDA受体的激活诱导CREB(cAMP-response element binding protein)的Ser133位点磷酸化，激活CRE依赖的转录。其中［22］，两个基因参与了突触NMDA受体依赖的神经保护。一个是BTG2，潜在的抗凋亡 CREB作用靶基因;另一个是BCL6，p53基因的转录抑制因子，同为潜在的CREB作用靶基因。

NF-kB是Rel家族的一员，属于转录因子。NMDA受体的激活增加NF-kB的亲和性，也提高了I-kB的磷酸化，参与NMDA受体的神经保护作用［23］。还有一类受CRE调控的神经营养因子 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)，NMDA受体激活后上调其表达，提高神经元的存活状态。经过长时间的研究，人们发现NMDA受体和细胞外信号调节激酶1/2-cAMP应答元件结合蛋白(ERK1/2-CREB)信号通路失耦联导致BDNF表达下降［24］，可能是导致神经元大量凋亡的原因。另外还有一些转录因子，如 Elk、SRF、NFAT、AP1 等是否参与 NMDA受体介导的神经保作用，还没有详细的机制阐释，有待进一步研究［25］。

3 NMDA受体神经保护作用的亚单位依赖性

NMDA受体既具有神经保护作用，又参与兴奋毒性，目前并不是非常清楚NMDA受体这种双重作用的分子机制。最初大家认为，是NMDA受体介导的Ca2+内流程度导致了功能的差异，中度的NMDA受体活性对神经元是有益的，而如果大量激活NMDA受体，导致钙超载，则导致细胞死亡。后来研究发现，NMDA受体NR2亚单位起到调节通道电生理和药理特性，以及介导不同细胞内信号通路的作用。例如，含NR2A的NMDA受体亚型与含NR2B的NMDA受体亚型，在突触可塑性中可能起到截然不同的作用［26-27］。那么，NMDA受体的神经保护作用或者神经损伤作用是否也同样有这种亚单位的差异呢?对于这一问题，目前还没有明确的定论。不过很多研究都倾向于含NR2B的受体亚型参与了NMDA受体介导的兴奋毒性作用，而含 NR2A的受体亚型则参与了NMDA受体介导的神经元保护作用［28］。但是也有些研究提示，不同部位的NMDA受体介导不同的作用。例如Hardingham小组的研究提示，突触部位NMDA受体的激活可以通过促进PI3/Akt，ERK/CREB等通路激活，产生神经保护作用，而突触外NMDA受体的激活则更倾向于介导神经损伤作用。在Hardingham的研究中同样发现，NMDA受体的这种神经保护作用是可以被ifenprodil所阻断。这提示此作用是含NR2B的NMDA受体亚型所依赖的。本实验室的研究也提示，神经元饥饿模型的NMDA受体保护作用可以被ifenprodil阻断，但是不能被PPPA(含NR2A的NMDA受体亚型拮抗剂)阻断(数据未发表)。当然，NMDA受体的功能还有可能受到不同的发育阶段，不同的脑区，甚至不同的疾病模型的影响。最近研究发现，在NMDA受体庞大的信号网络中，存在一些关键因子，影响或决定了NMDA受体功能的导向。例如 DAPK1(death-associated protein kinase)，脑缺血可以将DAPK1征募到突触外的NMDA受体，导致NR2B亚单位S1303位点发生磷酸化，改变通道功能，并最终引起细胞凋亡/死亡［29］。因此，我们还不能肯定地说究竟是哪种受体亚型，或者哪种细胞定位的受体决定了NMDA受体介导神经保护或者神经损伤功能。

4 对NMDA受体研究的展望

目前的研究提示，对于神经元来说，其生物学反应对NMDA或者谷氨酸的感受过程可以用钟型曲线来描述:当刺激逐渐增加时神经元的兴奋性反应增加，到达最高峰后，刺激的增加导致神经元反应的下降，即经典的钟型反应曲线学说［17］(classic bell-shaped curve model)，适度的NMDA受体激活能够提供神经元存活的几率，过弱或过强的对NMDA受体的刺激都会引起神经元的死亡［29］。Ca2+又是死亡信号痛路中最为重要的第二信使，钙离子浓度的阈值是一个分界点。该阈值(threshold)浓度是激活神经元存活通路信号的全程扳机点(trigger point)，通过下游信号通路上的PI3K、ERK1/2、CaMKIV的激活产生神经元存活效应，一旦Ca2+超过该阈值就会发生毒性水平的一些列生化事件，激活具有神经毒性的信号通路，通过激活Calpain、线粒体Ca2+重吸收或者NO的产生，造成使神经元死亡的严重后果［30］。适当地激活NMDA受体有利于神经元的存活和神经元保护作用，过度地激活NMDA受体后，只会产生相反的生物学效应，致死神经元。因此，在将来针对神经保护作用的药物研发中，NMDA受体的这一特点都需要更加引起人们的重视。

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Mechanism of NMDA receptor-dependent neuronal survival and neuroprotection

DU Song，LUOJian-hong，QIU Shuang
(Institute of Neuroscience，College of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

NMDA(N-methyl-D-aspartate)receptors are a subtype of glutamate receptor，and play an important role in both synaptic transmission and synaptic plasticity.When excessively excited，NMDA receptors can cause cell death in many neuropathological scenarios such as OGD(oxygen and glucose deprivation)and brain injury.However，recent studies have revealed that under the physical and some pathological conditions，NMDA receptor could promote neuronal survival and protect neurons from damage.

Brain injuries/drug ther;Neurons/drug eff;Synaptic transmission;NMDA receptor;Survival;Mechanism

R 651.15

A

1008-9292(2011)04-0440-06

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.04.017

2010-11-15

2011-01-25

国家“蛋白质重大科学研究计划”项目(2010CB912002);国家自然科学基金重点项目(30730038);浙江省自然科学基金(Y2100425).

杜 嵩(1982-)，男，硕士研究生，神经生物学专业.

邱 爽(1976-)，女，博士，副教授，从事神经生物学研究;E-mail:qiushly@zju.edu.cn

［责任编辑 张荣连］