提高嗜酸乳杆菌在豆乳中发酵性能的研究

吕慧超，熊宇生，刘伦伦，夏延斌

（湖南农业大学食品科学技术学院，长沙410128）

提高嗜酸乳杆菌在豆乳中发酵性能的研究

吕慧超，熊宇生，刘伦伦，夏延斌

（湖南农业大学食品科学技术学院，长沙410128）

测定了嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵豆乳的单菌产酸曲线与混菌产酸曲线，并采用正交实验分析了它们对发酵豆乳的品质影响及与单菌发酵豆乳贮存期质量变化的比较。结果表明，嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌是影响酸豆乳质量的主要因素，嗜热链球菌次之。按体积分数为2.2%嗜酸乳杆菌、体积分数为3.0%保加利亚乳杆菌、体积分数为1.8%嗜热链球菌配比共同发酵，可得到组织状态、口感风味较好的酸豆乳，克服了单一嗜酸乳杆菌发酵豆乳产酸慢、凝乳时间长、活菌数不高且贮存期活菌数下降快的缺陷。

豆乳；嗜酸乳杆菌；发酵性能

0 引言

豆乳，又称豆奶，是一种营养丰富的传统食品，含优质大豆蛋白、大豆异黄酮、多种维生素和矿物质，并且不含胆固醇。但在中国市场上，豆奶产品似乎一直在牛奶和豆浆的夹缝中生存[1]。发酵豆乳是以豆乳为原料，加入少量奶粉或某些可供乳酸菌利用的糖类作为发酵促进剂，经乳酸菌发酵而生产的酸性豆乳饮料[2]，改善了豆乳风味的同时也为其健康发展提供了出路。

嗜酸乳杆菌是一种肠道益生菌，被视为“第三代酸乳发酵剂菌种”[3]。其发酵乳制品的生产特性较差，凝乳时间较长，产品口感风味也有一定缺陷[4,5]。我国对嗜酸乳杆菌的研究却还处在起步阶段，与其它乳酸菌的混合发酵目前研究较少，即使有也仅限于工艺方面的研究。关于其与其它乳酸菌在豆乳中混合发酵还没有深入的研究报道。因此，探索乳酸菌在豆乳中的发酵性能对设计豆乳发酵剂以及制定发酵工艺甚至产品工艺都是非常重要的。

1 实验

1.1 材料

大豆；蔗糖；无糖脱脂奶粉；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，La），由保健品中分离；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgarious，Lb)；嗜热链球菌（Streptoccous themophilus，St)。

活菌计数培养基：总菌数以MRS培养基计数，嗜酸乳杆菌菌数以山梨醇-MRS培养基计数。

豆乳培养基：选豆(挑选表面光泽无霉烂变质的大豆)——浸泡(0.25%的Na2CO3和KCl按1︰1，常温浸泡10 h左右）——磨浆去渣(将浸泡好的大豆用热水中浸泡10 min，捞出于磨浆机中磨浆，滤渣收取豆浆)——均质(25 MPa,10 min)——杀菌(121℃，15 min)——室温冷却备用制得大豆乳培养基。

脱脂乳培养基按乳粉︰水=1︰8复原，121℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 评价方法

感官评价：本研究由20个经过酸乳感官评价培训的人组成小组，对酸豆乳按表1进行感官评价；正交实验中，综合评分=酸度（30%）+感官评分（40%）+活菌数评分（30%）。

表1 感官评价分数

1.2.2 酸度滴定

准确吸取摇匀的待测样品10 mL，加20 mL蒸馏水混合均匀，滴加2滴酚酞，用浓度为0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定，用消耗的NaOH体积乘以10即得酸度值。

1.2.3 菌种驯化

按豆乳体积分数为0%，10%，30%，60%，90%，100%逐步增大的方法制备豆乳驯化培养基，将在脱脂乳中活化好的菌种先分别接种于10%驯化培养基中，待其凝乳后再转接入该浓度豆乳中，经过几次驯化直到其凝乳时间缩短至6～8 h，再将其转接至下一浓度豆乳培养基中，如此直到每种菌完全适应豆乳环境的生长。驯化培养过程中，若发现凝乳时间增长或有乳清析出，及时分离菌种复壮，再进行下一步的驯化。

1.2.4 耐酸实验

采用MRS液体培养基，用浓度为0.1 mol/L的HCl溶液调节pH值分别为l.0，2.0，3.0，4.0，模拟胃酸环境。然后接种相同量经MRS液活化好的嗜酸乳杆菌菌种，将原液（pH值为6.5）与四组实验组共同放入37℃培养箱中培养2 h，马上拿出用MRS培养基进行活菌计数，72 h后观察实验结果。存活率=lgn1/lgn0·100%，其中lgn1为不同pH梯度的活菌数(对数值)，lgn0原液中的活菌数（对数值）[6]。

2 结果与讨论

2.1 单菌产酸曲线测定

将充分活化的嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌分别以体积比（以下同）为8%的接种量接入豆乳培养基中，每隔2 h测定1次酸度，绘制单菌产酸曲线，结果如图1所示。

由图1可以看出，由于豆乳培养基中含有氨基酸、糖类、蛋白质等营养成分，所以菌种随发酵时间的延长，产酸量不断增加，开始时La产酸速度是最快的，但6 h以后Lb产酸最快且最终产酸量最高，其次是La。St产酸速度最慢，且产酸量最低。实验过程中还发现，La和Lb发酵豆乳基本无豆腥味及其他异味，且Lb凝乳最快，由此可增大Lb在混合菌种中的比例进行发酵。

2.2 混菌产酸曲线的测定

以嗜酸乳杆菌为主发酵菌种，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌为辅发酵菌种，将充分活化好的3种菌分别以La+Lb,La+Lb+St,La+St混合菌种（均按体积比为1︰1的比例）模式，按体积分数为8%的接种量接入纯豆乳培养基中，于40℃恒温箱中培养，每隔2 h测定一次酸度，绘制混菌产酸曲线如图2所示。

图2 混菌产酸曲线的测定

由图2可以看出，La+Lb混合发酵豆乳产酸速度是最快的，且最终酸度在70°T以上，达到了酸奶制品所需酸度要求（通常在70°T-90°T之间）。La+Lb+St产酸速度次之，但两者相差不大，而La+St产酸最慢且最终酸度远低于所需酸度要求。可见La与Lb两者在豆乳中有一定的互生效应，其共生机制还有待进一步研究。但考虑到La+Lb+St与其产酸相差不大，且3种菌共同发酵组织状态和气味都较好，因此选用3种菌共同发酵。

2.3 驯化前后混菌发酵产酸曲线测定

将驯化前后的菌种分别按La︰Lb︰St=1︰1︰1的比例，接入（接种量8%）纯豆乳锥形瓶培养基中进行扩大培养后，再转接到实验培养基中，实验条件与方法同单菌产酸曲线测定，结果如图3所示。

图3 驯化前后混菌发酵产酸曲线

由图3可以看出，未驯化的菌种发酵豆乳虽然能使其凝乳，但凝乳时间长，且最终酸度低于70°T。由图比较可以看出，驯化前菌种酸度达到70°T需要20 h，而驯化后的菌种只需12 h左右，即缩短了8 h;凝乳时间也从原来的16 h缩短到了8 h。可见驯化后的菌种比未驯化的菌种产酸速度明显增快且最终产酸量增加，约增加了21.7%。通过活菌计数还发现，各种菌活菌数均达到108，与未驯化的相比均有一定程度的增加。

2.4 3种菌对发酵豆乳质量影响正交实验

采用驯化后的菌种，采用k(3 3)正交实验设计表（因素水平见表2），在40℃条件下恒温培养发酵8 h，然后置于4℃冰箱中冷藏后熟24 h,进行相关评价与测定。正交实验结果如表3所示。菌种优选实验后熟时酸度、乳酸菌数、感官评分及其综合评分的极差分析结果如表4所示。

表2 菌种优选实验因素水平

表3 菌种优选实验正交实验结果

表4 极差分析结果

实验结果表明：3种菌发酵豆乳时，对乳酸菌总菌数的影响最大的是La，其次是St，三者的影响次序为La＞St＞Lb；对后熟时酸度影响的主要因素是Lb＞La＞St；对感官评分影响最大的是La,Lb次之，最后是St,即La＞Lb＞St,并且随着A、B因素的增加，有利于风味的提高。3个因素对于酸豆乳综合评分也就是质量影响大小为La＞Lb＞St,即嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌是影响豆乳发酵的主要因素，在豆乳中发酵性能较好，而嗜热链球菌次之。

2.5 驯化后的嗜酸乳杆菌耐酸实验

人体胃酸环境pH值通常在2以下，但随食物摄入的稀释作用可上升至3.5左右。嗜酸乳杆菌进入人体后，首先要抵御胃酸环境[7]。本实验设置了pH值为1～4的MRS液，以模拟胃酸环境，测得菌种存活率如图4所示。

由图4可以看出，在pH值为3和4的环境中，嗜酸乳杆菌都能保持较高的活菌数，达到90%以上，而pH值为2时存活率下降到了85%，此时活菌数量级为107；pH值等于1时存活率更是下降到57.3%，其活菌数量级也由原液的109降低到105。由此可以看出，pH值越低，活菌数下降越快。嗜酸乳杆菌能发挥保健效果的剂量不应该低于106mL-1或106g-1，摄入食物后，胃酸环境通常在2以上，故驯化后的嗜酸乳杆菌能发挥其保健作用。

2.6 混菌发酵乳与单菌发酵品贮存期间质量变化

在相同条件下培养La+Lb+St(接种量为La2.2%,Lb3.0%,St1.8%)混菌发酵豆乳（A)和单纯La(接种量为7%)发酵豆乳（B），待其凝乳后，取出置于4℃冰箱中，每隔两天取样进行酸度、活菌总数测定及感官评价，结果如表5所示。

图4 驯化后嗜酸乳杆菌耐酸试验

表5 最佳组合结果

2.6.1 感官特征比较

由上表可以看出，随着贮存时间的延长，酸豆乳的酸度不断增加，但在正常贮存期内不超过100°T，在一定程度上有助于酸豆乳风味的提高。用混合菌种发酵的酸豆乳比用单一嗜酸乳杆菌发酵豆乳效果好，且发酵质量相对稳定。A第8 d开始有乳清析出，B第4 d就开始出现，并且析出量均随时间的延长而增多。

2.6.2 酸度变化情况

A种酸豆乳第4 d至第8 d是酸度增加最快的时候，第10 d后酸度增加较缓慢。从整体上来看，A酸豆乳酸度上升较B慢，而酸度上升慢更有利于酸豆乳风味的提高和乳酸菌活力的保持，故A种酸豆乳更适合工业上生产。

2.6.3 活菌数测定

从表中可以看出，A和B中活菌数都随时间的延长而呈下降趋势，第8 d之后下降得尤为快速，第12天后又趋于平缓，但基本上都有108个数量级。A中嗜酸乳杆菌数14 d时存活数还有0.21×108mL-1，达到了的保健效果剂量。但B中嗜酸乳杆菌活菌数明显下降，且第10 d数量级已降低到106。故利用3种菌混合发酵明显优于嗜酸乳杆菌单菌发酵。

3 结论

（1）测定了3种菌在酸豆乳中单菌产酸情况和混菌产酸情况，利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌共同发酵，可提高嗜酸乳杆菌在豆乳中的活菌数和贮存期菌种活力，并且能够缩短发酵时间，提高最终产酸量。

（2）通过正交实验分析了3种菌对发酵豆乳质量的影响,结果表明嗜酸乳菌、保加利亚乳杆菌是影响发酵豆乳质量的主要因素，嗜热链球菌次之。

（3）探索出最佳菌种比例La为2.2%，Lb为3.0%，St为1.8%，可得到品质较好的发酵豆乳，且最终活菌数可达108个数量级，比单一嗜酸乳杆菌发酵豆乳具有明显的优势。

[1] 高雪丽，梁保安.酸豆奶的研究现状及展望[J].农产品加工：创新版,2009(12):1-2.

[2] 韩璞，田洪涛.发酵大豆乳优良乳酸菌菌种的筛选及其发酵性能的研究[J].现代食品科技2009,25(3):1.

[3] 孟岳成，姜涛.嗜酸乳杆菌发酵豆乳工艺的研究[J].中国乳品工业，2008，36(3):1-2.

[4] LANKAPUTHRA W E V．SHAH N P．Investigation of Factors Affecting Viability of LactobacillusAcidophilus and Bifidobacteria in Yoghurt[C]．24th Inter Diary Congress，Melbourne，Australia,1994：18-22.

[5] KANBE M．Functions of Fermented Milk：Challenges for the Health．Science[M]．Elsevier ApplSci Publ，London，1992．

[6] 范兴艺.嗜酸乳杆菌的分离、鉴定及其在发酵豆乳中生长特性的研究[D].浙江大学，2008.

[7] 上海第一医院主编．人体生理学[M]．北京：人民卫生出版社，1978：134-139．

Study on improving the fermentation performance of Lactobacillus acidophilus in soybean milk

LV Hui-chao，XIONG Yu-sheng，LIU Lun-lun，XIA Yan-bin
（College of Food Science and Technology,Hunan Agriculture University,Changsha 410000,China)

In this study,Single curves and the mixed lactic acid bacteria acid production curves of Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus bacteria fermented soybean milk were determined.By using the cross-experimental analysis method,their impact on the quality of fermented soybean milk were studied.Also,the quality changes of mixed bacteria and single-strain fermented soybean milk were compared during storage period.The results shows that Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus are the main factors in fermented soybean milk,followed by Streptococcus thermophilus;In accordance with the proportion of 2.2%Lactobacillus acidophilus,3.0%Lactoba cillusbulgaricusand1.8%Streptococc-us thermophilus to co-ferment soybean milk,we can get organized state and good taste,which overcomes the defects of single Lactobacillus acidophilus in fermented soybean milk that produce acid slowly,curd for a long time,not high number of viable cells and fast-decreasing viable cells during storage period.

soybean milk；Lactobacillus acidophilus；fermentation performance

TS252.54

A

1001-2230（2011）03-0038-04

2010-12-15

吕慧超（1990-），女，本科，研究方向为食品微生物发酵。通讯作者：夏延斌