瑞士乳杆菌发酵乳清产物抗氧化活性的条件优化

包毅宁，胡易，王正珊，赵征

（天津科技大学，天津300457）

瑞士乳杆菌发酵乳清产物抗氧化活性的条件优化

包毅宁，胡易，王正珊，赵征

（天津科技大学，天津300457）

应用产蛋白酶活力强的瑞士乳杆菌发酵乳清，讨论了发酵时间、发酵温度、发酵初始pH值和瑞士乳杆菌接种量等条件对产物抗氧化活性的影响。在单因素实验的基础上，进行正交实验，得到抗氧化活性最高产物的发酵条件为发酵温度37℃、乳清初始pH值为6.0、瑞士乳杆菌接种量（体积分数）5%和连续培养18 h。在此条件下，发酵产物的羟自由基清除能力达到54.73%。证明了瑞士乳杆菌发酵乳清产物具有优于未发酵乳清的较强抗氧化活性，在现有酶解法的基础上开辟了制备乳清源抗氧化肽的新途径。

瑞士乳杆菌；乳清；抗氧化；羟自由基；水解

0 引言

随着干酪产业的蓬勃发展，乳清再利用受到了人们的重视。乳清具有多方面的功能性，近年来乳清的抗氧化性成为研究热点，提高乳清抗氧化活性的方法目前主要为酶解法。Pena-Ramos等发现乳清分离蛋白酶解产物在脂质系统中有良好的的抗氧化能力[1]；赵文博等证明了碱性蛋白酶可提高乳清的抗氧化能力[2]。瑞士乳杆菌是一种高产蛋白酶活性的乳酸菌[3]，Kapila等对用瑞士乳杆菌发酵乳清和添加WPC乳清的发酵条件进行优化。体外试验结果表明，瑞士乳杆菌水解产物具有很好的抗氧化活性[4]。本工作拟利用瑞士乳杆菌发酵浓缩乳清，利用乳酸菌所产蛋白酶将乳清蛋白水解，以提高乳清的抗氧化活性，力求为乳清功能性的提高提供酶解以外的新途径。

1 实验

1.1 材料与仪器

瑞士乳杆菌（天津科技大学干酪科学与工程研究室保藏），鲜牛乳，盐酸、FeSO4、双氧水、水杨酸（分析纯）。

乳脂分离机（9N-100），立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SⅡ），电热恒温水浴锅（HWS26型），紫外可见分光光度计（752E），pH计（FE20），RE-52AA旋转蒸发器，5804R低温离心机，BCM-1000A型生物洁净工作台，LRH-250培养箱，真空冷冻干燥机。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

鲜牛乳加热至35℃→脱脂→杀菌（63℃/30 min）→冷却至45℃→加稀释比1︰9的盐酸至pH值为4.6并不断轻轻搅拌[5]→过滤除去酪蛋白得到酸乳清→55～60℃真空旋蒸除去原体积2/3的水→调节浓缩乳清的pH→灌入无菌三角瓶→杀菌（63℃/30 min）→接种瑞士乳杆菌→静置发酵→4℃离心除去菌体→上清液灭酶（沸水浴5 min）→真空冻干（-55℃/48 h）得产物→测定产物的1%溶液的抗氧化性。

1.2.2 瑞士乳杆菌活化方法

瑞士乳杆菌冻干菌粉接入质量分数为12%灭菌的脱脂乳粉复原乳进行活化，凝乳后按体积分数为3%接种量接入10 mL液体MRS培养基中培养12 h，然后后按体积分数为3%接种量接入100 mL液体MRS培养基中培养12 h后使用。

1.2.3 抗氧化指标的测定

清除羟自由基能力。在10 mL试管中依次加入浓度为6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，发酵产物溶液2 mL和浓度为6 mmol/L的H2O2溶液2 mL，摇匀，静置10 min。再向Ai各管加入浓度为6 mmol/L的水杨酸溶液2 mL，同时向Aj各管加入2 mL蒸馏水，摇匀，静置30 min后以5 000 r/min离心5 min，于510 nm处测吸光度[6]。每个样品测3次，取平均。清除率计算公式为

清除率=[1-(Ai-Aj/A0)]×100%，

式中：A0为空白对照；Ai为有水杨酸时水解产物的吸光度；Aj为无水杨酸时水解产物的吸光度。

1.2.4 单因素实验

（1）时间的影响。培养温度42℃，发酵初始pH值为6.0，接种量（体积分数）5.0%，每隔2小时取样，冻干后测产物抗氧化活性。

（2）温度的影响。发酵初始pH值为6.0，接种量（体积分数）5.0%，分别置于25，30，37，42，50℃培养箱内培养18 h后取样，冻干后测产物抗氧化活性。

（3）初始pH值的影响。培养温度42℃，发酵初始pH值分别为5.0，5.5，6.0，6.5和7.0，接种量（体积分数）5.0%，培养18 h，冻干后测产物抗氧化活性。

（4）瑞士乳杆菌接种量的影响。培养温度42℃，发酵初始pH值为6.0，瑞士乳杆菌接种量（体积分数）分别为0%，2.5%，5.0%，7.5%和10.0%，培养18 h，冻干后测产物抗氧化活性。

正交实验结果如表1所示。

2 结果与讨论

2.1 时间对产物抗氧化活性的影响

图1为发酵产物抗氧化性与发酵时间的关系。由图1可以看出，瑞士乳杆菌发酵浓缩乳清产物的抗氧化活性随发酵时间延长呈增加趋势，到18 h达到49.24%。发酵18 h后，产物的抗氧化活性开始降低，实验中测得发酵至48 h的水解产物的羟自由基清除能力为45.76%，略高于发酵20 h的产物。由发酵液中活菌数曲线可以看出从16 h到18 h的发酵过程中活菌大量死亡，其破裂释放的胞内蛋白酶进一步水解乳清蛋白产生了抗氧化肽，故18 h的水解产物呈现出更好的抗氧化活性。

2.2 温度对产物抗氧化活性的影响

温度影响微生物的各种代谢过程和酶催化的各种生化反应速率，从而影响菌体的生长和蛋白酶的水解效力。温度还通过改变发酵液的物理性质，如样的溶解度、基质的传递速率及菌体对养分的分解和吸收速率，间接影响微生物的生长和产物的形成。图2为发酵产物抗氧化性与发酵温度的关系。由图2可以看出，瑞士乳杆菌发酵浓缩乳清产物的抗氧化活性随发酵温度升高呈增加趋势，当发酵温度为42℃时达到52.54%。温度继续升高，抗氧化活性显著下降。这可能是由于瑞士乳杆菌产酶及所产蛋白酶的最适作用温度在37～42℃，温度过高影响了乳酸菌产酶和所产蛋白酶的水解作用，进而减少了抗氧化肽的生成量，降低了产物的抗氧化活性。

图2 产物抗氧化性与温度的关系

2.3 pH值对产物抗氧化活性的影响

乳清的初始pH值可能从两个方面影响瑞士乳杆菌的生长和蛋白水解能力：一是影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜渗透性的变化，从而影响菌体对养分的吸收；二是影响菌体细胞内各种酶活、菌体对基质的利用速率和细胞的结构，从而影响菌体的生长和产蛋白酶能力[7]。图3为发酵产物抗氧化性与发酵初始pH值的关系。由图3可以看出，瑞士乳杆菌发酵浓缩乳清产物的抗氧化活性随在初始pH值为6.5时达到最大，此条件下的清除率为51.3%，这与瑞士乳杆菌的最适生长pH值为6.2～6.4相近，说明在此条件下瑞士乳杆菌能够较高的吸收养分，且具有良好的产酶活性。

图3 产物抗氧化性与pH值的关系

2.4 接种量对发酵产物抗氧化活性的影响

图4为发酵产物抗氧化性与接种量（体积分数）的关系。由图4可以看出，瑞士乳杆菌发酵浓缩乳清产物的抗氧化活性在接种量（体积分数）为7.5%时清除率达到51.92%，高于接种量为10%时产物的抗氧化活性，这可能是由于接种量增大使培养过程中菌体之间竞争营养物质而大量死亡，释放了过量的蛋白酶使乳清蛋白水解为抗氧化肽后又进一步水解，抗氧化活性降低。

图4 产物抗氧化性与接种量的关系

2.5 正交实验

正交实验由表2所示。由表2可以看出，对瑞士乳杆菌发酵乳清水解产物抗氧化活性影响程度大小按顺序依次为发酵温度＞发酵时间＞接种量＞发酵液初始pH值。最佳发酵条件为：发酵温度37℃，发酵时间18 h，发酵初始pH值为6.0，接种量（体积分数）10%。

对发酵条件优化实验进行方差分析，结果如表3所示。方差分析结果显示，以初始pH为误差项，在a=0.05水平上，发酵温度和发酵时间具有显著性，接种量和初始pH没有显著性。综合考虑方差分析结果与经济因素，选择发酵条件为培养温度37℃、培养时间18h、发酵初始pH6.0、接种量5%，所得水解产物的羟自由基清除率为54.73%。而对照组中未接种瑞士乳杆菌乳清的羟自由基清除率为33.21%。

表2 正交实验结果

表3 方差分析

3 结论

瑞士乳杆菌可以显著提高浓缩乳清的抗氧化活性，发酵初始pH值为6.0、瑞士乳杆菌接种量（体积分数）5%的浓缩乳清在37℃发酵18 h后，所得水解产物的羟自由基清除率为54.73%。与酶法水解相比，用微生物水解法制备生物活性肽直接利用微生物发酵过程中产生的复合蛋白酶降解蛋白质，经过优化可达到较高的水解度，从而降低了制备低聚肽的成本，为综合开发利用乳清提供了思路。

[1] PENA-RAMOS E A,XIONG Y L.Antioxidative Activity of Whey Protein Hydrolysates in a Liposomal System[J].Journal of Dairy Science,2001,84:2577–2583.

[2] 赵文博,包毅宁,赵征.干酪乳清水解产物的抗氧化活性研究[J].中国乳品工业,2010,38(2):13-15.

[3] 张重阳,潘道东.瑞士乳杆菌产蛋白酶的培养和提取条件的研究[J].食品科学,2006,27(10):416-419.

[4] KAPILAS，LAXMINJ，AJAYKD，etal.Augmentationof biofunctionalpropertiesofwheyproteinonfermentationwith Lactobacillus helveticus.Milchwissenschaft[International milk science],2009,64(3）:245-249．

[5] 侯永新.酸法生产干酪素主要工艺条件的研究[J].食品工业科技,2005,26(10):138-139.

[6] SMIRONFF N,CUMBES Q J.Hyroxyl Radical Scavenging Activity of Compatible Solutes[J].Phytochemistry,1989,28:1057-1060.

[7] 郭宇星.微生物法发酵乳清粉制备生物活性肽的研究[D].天津:天津商学院,2006.

Optimum fermentation conditions ofLactobacillus helveticusfor producing antioxidative cheese whey

BAO Yi-ning,HU Yi,WANG Zheng-shan,ZHAO Zheng
(Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

This study focused on the antioxidative property of cheese whey fermented by aLactobacillus helveticuswhich was proved to be excellent on producing the proteinase.After the single factor tests,the orthogonal test was carried out to obtain the optimal fermentation con dition to get the product with the best antioxidative activity.The optimal fermentation conditions are as following:incubation temperature 37℃,initial pH 6.0,inoculation 5%(vol/vol),and fermented 18 h.After fermented in this condition,the ability to eliminate free radical of the product is up to 54.73%.This study proved that after fermented by theLactobacillus helveticus,the antioxidative activity of the cheese whey could be improved,and developed a new way to prepare the antioxidative peptides from whey.

Lactobacillus helveticus;whey;antioxidation;free radical；hydrolysis

Q93-33

A

1001-2230（2011）03-0007-03

2010-11-30

天津市科技攻关项目“瑞士乳杆菌发酵技术及其系列产品的工业化开发”（06YFGZSH02300）。

包毅宁（1985－），女，硕士研究生，研究方向为乳品科学与技术。

赵征