5味收涩药对奶牛乳腺炎病原菌体外抗菌活性的比较

代敏，彭成，万峰，陈丹丹

（1.成都中医药大学中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室，成都610075；2.成都医学院，成都610083）

5味收涩药对奶牛乳腺炎病原菌体外抗菌活性的比较

代敏1,2，彭成1，万峰1，陈丹丹1

（1.成都中医药大学中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室，成都610075；2.成都医学院，成都610083）

采用琼脂平板二倍稀释法测定了诃子等5味收涩药对15个种属33种120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌浓度，统计分析了它们对葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和单胞菌等共11个种属的MIC50和MIC90，并采用SPSS17.0软件中单因素方差分析法比较分析了5味收涩药分别对葡萄球菌、鲁氏不动杆菌和芽孢杆菌等11个种属菌株抑菌活性的强弱。结果表明，5味收涩药对受试菌均有较强的抗菌活性，总体以诃子的抗菌活性最强，其次为乌梅和石榴皮，再次为五味子，活性最差为山茱萸；且5味收涩药对革兰氏阳性菌的抗菌活性较对革兰氏阴性菌的活性强。

体外抗菌活性；收涩药；乳腺炎病原菌

0 引言

收涩药指具有敛肺涩肠、固精缩尿、止血敛疮等作用的药物，其中诃子、石榴皮、乌梅、五味子和山茱萸具有涩肠止泻，敛肺止咳、杀虫、驱虫止痢、补益肝肾等功效[1-4]；现代药理学研究表明，诃子、石榴皮、乌梅、五味子和山茱萸具有抗病原微生物、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、驱虫、抗过敏等药理活性[5-14]。此外，乌梅、五味子和山茱萸又常作为“药食同源”植物，被用作功能性保健食品[15,16]。鉴于收涩药的涩肠止泻之功效及其抗病原微生物等药理活性，本试验旨在对诃子、石榴皮、乌梅、五味子和山茱萸的体外抗菌活性进行比较研究，一方面为其在感染性疾病及保健食品的运用提供科学依据，另一方面为防治奶牛乳腺炎抗菌中药的筛选及运用奠定基础，以提高乳品安全。

1 实验材料

1.1 药物

诃子、五味子、乌梅、石榴皮和山茱萸共5味收涩药（同仁堂成都分店）。

1.2 菌株

①质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923（成都抗菌工业研究所）；

②受试菌株：分离于四川成都、绵阳、眉山三地不同规模化奶牛场，并经VITEK 32全自动微生物分析系统和16S rDNA序列分析鉴定的15个种属33种120株奶牛乳腺炎病原菌（见表1）。

表1 实验菌株的种类、数量及代号

表1中，凝固酶阴性葡萄球菌包括5株耳葡萄球菌、5株腐生葡萄球菌、4株木糖葡萄球菌、3株葡萄球菌属、2株人葡萄球菌以及表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、科氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、尼泊尔葡萄球菌各1株；4株链球菌包括无乳链球菌-（B群）、乳房链球菌、牛链球菌和缓症链球菌各1株；9株芽孢杆菌包括4株蜡样芽胞杆菌、3株矮小芽孢杆菌和2株弯曲芽孢杆菌；12株单胞菌包括6株铜绿假单胞菌、3株少动鞘氨醇单胞菌、2株荧光假单胞菌、1株豚鼠气单菌。

1.3 培养基

Mueller-Hintonagar（OXOID，批号729683）。

1.4 主要仪器

多点接种仪（SAKUMA MIT-P型），VITEK DENSICHEK，LABO AUTOCLAV（MLS-3780型），CO2INCUBATOR(MOC-15A)，调温电热套（ZDHW 2000L）。

2 实验方法

2.1 药物提取

称取药物150.0 g，根据药物质地不同，分别加入10倍75%乙醇回流提取2 h，过滤，收集滤液；再用8倍75%乙醇回流提取1 h，合并两次醇提物滤液。滤渣加入8倍蒸馏水回流提取1 h，过滤，收集滤液；再次加入6倍蒸馏水回流提取0.5 h，过滤，收集滤液，合并两次水提滤液。将水提物和醇提物的浓缩液混合，定容至0.75～2.0 g/mL。

2.2 提取物的灭菌和保存

108℃灭菌2 min，-20℃冰箱保存备用。

2.3 体外抑菌活性试验

采用琼脂平板二倍稀释法测定5味收涩药对15个种属120株奶牛乳腺炎病原菌和质控菌株的体外抑菌活性。具体方法参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）抗微生物药物敏感性试验执行标准[17]。

含药平板制备：用无菌水对受试药进行倍比稀释，将各提取物分别稀释成1︰2，1︰4，1︰8，1︰16，1︰32，1︰64，1︰128，1︰256共8个梯度。在一次性无菌培养皿中分别加入不同浓度梯度的稀释药液1 mL和14 mL灭菌的MH培养基，充分混匀，烘干至表面无水蒸气。以平板内加入1 mL生理盐水代替药物制备阳性对照平板。

菌液配置：用麦氏比浊仪将受试菌和质控菌用无菌生理盐水调至菌液为0.5麦氏浓度。

最低抑菌浓度（MIC）的测定及结果判定：采用多点接种仪将菌液加入不同质量浓度梯度的含药平板和阳性对照平板，并以无菌生理盐水代替菌液作阴性对照。37℃恒温培养18～24 h后观察各菌株的生长情况。在阴性、阳性对照成立的条件下，以平板内无细菌生长的药物最小浓度为此药对该菌株的最低抑菌质量浓度。

2.4 数据统计

对含4株以上的同种属菌株，分别统计其抑制50%和90%菌株的最低抑菌浓度，即MIC50和MIC90；并用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析法比较分析5味收涩药对同种属菌株抑菌活性的强弱。

3 结果与分析

3.1 5味收涩药的最低抑菌浓度

采用琼脂平板二倍稀释法测定了诃子、五味子、乌梅、山茱萸和石榴皮对15个种属120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌浓度，结果如表2所示。

表2 5味收涩药对奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌质量浓度g/L

由表2可以看出，诃子、五味子、乌梅、山茱萸和石榴皮5味收涩药对15个种属33种120株奶牛乳腺炎病原菌和质控菌均有较强的抗菌活性，其最低抑菌质量浓度因药物和菌株种属差异而明显不同。

3.2 5味收涩药的MIC50和MIC90

统计分析了诃子等5味收涩药对金葡菌、凝固酶阴性葡萄球菌、吉氏库特氏菌、巨型球菌、链球菌、大肠埃希菌、单胞菌属、鲁氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、产吲哚金黄杆菌和芽孢杆菌共11个种属菌株的MIC50和MIC90，结果如表3所示。

比较分析诃子、五味子、乌梅、山茱萸和石榴皮的MIC50和MIC90，发现体外抗菌活性最强的是乌梅和石榴皮，其中乌梅除对阴沟肠杆菌的MIC50为12.50mg/ml，对大肠埃希菌、单胞菌、产吲哚金黄杆菌和芽孢杆菌的MIC50为6.25 mg/mL外，对其余种属菌株的MIC50均为3.13 mg/mL；而石榴皮除对大肠埃希菌、单胞菌、鲁氏不动杆菌和阴沟肠杆菌的MIC50分别为25.00～50.00，6.25～25.00，3.13～6.25 g/L和6.25 g/L外，对其余种属菌株的MIC50均介于1.56～3.13 g/L。其次为诃子，对革兰氏阴性菌的MIC50和MIC90分别为5.00～10.00 g/L和2.50～20.00 g/L，而对革兰氏阳性菌的MIC50和MIC90均介于1.25～5.00 g/L。再次为五味子，除对大肠埃希菌、单胞菌和阴沟肠杆菌的MIC50和MIC90较高外（8.33～33.33 g/L），对其余种属菌株的MIC50和MIC90均介于4.17～8.33g/L。抑菌活性相对最差的是山茱萸，除对大肠埃希菌和阴沟肠杆菌的MIC50和MIC90为25.00 g/L，对凝固酶阴性葡萄球菌、单胞菌和鲁氏不动杆菌的MIC90分别为6.25～12.50，12.50～25.00和6.25～12.50 g/L外，对其余种属菌株的MIC50和MIC90均为12.50 g/L。

3.3 5味收涩药体外抗菌活性的比较分析

用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析法比较分析了诃子、五味子、乌梅、山茱萸和石榴皮5种收涩药对不同种属菌株体外抑菌活性的强弱，结果如表4所示。

由表4可以看出，菌株种属不同，5味收涩药表现出的抑菌活性亦明显不同。对于金葡菌，以石榴皮（2.46 g/L）的抗菌活性最强，与五味子、乌梅和山茱萸具有统计学差异；其次为诃子（3.75 g/L）和乌梅（4.30 g/L）；再次为五味子（7.74 g/L）；最差为山茱萸（11.72 g/L），其最低抑菌浓度显著高于石榴皮、诃子和乌梅（P＜0.001）。对于凝固酶阴性葡萄球菌，以乌梅（3.53 g/L）和诃子（3.64 g/L）的体外抑菌活性最强，与五味子和山茱萸有统计学差异（P＜0.001）；其次为五味子（7.46 g/L）和石榴皮（8.56 g/L）；抑菌活性最差为山茱萸。对于吉氏库特氏菌、巨型球菌、链球菌和芽孢杆菌，总体以山茱萸的抑菌活性最差，与诃子、五味子、乌梅和石榴皮有统计学意义；诃子的体外抗菌活性最强，但诃子、五味子、乌梅和石榴皮之间无统计学差异。对于大肠埃希菌，以乌梅（8.46 g/L）和诃子（12.37 g/L）的体外抗菌活性最强；其次为五味子（21.05 g/L）和山茱萸（24.26 g/L），抑菌活性最差的为石榴皮（27.19 g/L）。对于单胞菌、鲁氏不动杆菌和阴沟肠杆菌，以诃子和乌梅的抑菌活性最强；其次为石榴皮和乌梅；最差为山茱萸，与诃子、乌梅、五味子和石榴皮比较有统计学差异。对于产吲哚金黄杆菌，以石榴皮（2.82 g/L）的活性最强；其次为诃子（4.38 g/L）和乌梅（5.21 g/L）；再次为五味子（8.33 g/L）；最差为山茱萸（11.46 g/L）。

表3 5味收涩药对奶牛乳腺炎病原菌的MIC50和MIC90g/L

表4 5味收涩药对奶牛乳腺炎病原菌体外抑菌活性的比较分析（X±S）g/L

4 讨论

本研究通过琼脂平板二倍稀释法测定了诃子、乌梅、石榴皮、五味子和山茱萸对15个种属33种120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌浓度，一方面排除了试管法中药物颜色对实验结果判定的影响，避免了菌株种类及数量少等客观因素对实验结果的影响，另一方面通过MIC、MIC50和MIC90的定量分析及现代统计学方法的综合运用，首次评价了5味收涩药体外抗菌活的性强弱。结果表明，5味收涩药中总体以诃子的抗菌活性最强，MIC为1.25～20.00 g/L，对大肠埃希菌和阴沟肠杆菌的抑菌活性相对最差，与李仲兴等[18]报道一致，其次为乌梅和石榴皮，其中乌梅的MIC为0.78～12.50 g/L，与文献[19,20]报道略有差异；石榴皮的MIC为1.56～50.00 g/L，与文献[21]报道出入较大，分析其原因，可能与药物产地、批次、提取方法及菌株来源等的差异有关，具体原因是否如此，有待进一步分析。再次为五味子，MIC为2.08～33.33 g/L。相对活性最差为山茱萸，MIC为1.56～25.00 g/L，除对大肠埃希菌的活性略强于石榴皮外，对其它种属受试菌的抑菌活性均弱于诃子、乌梅、石榴皮和五味子。比较分析药物对不同种属菌株的抑菌活性差异，发现5味受试药对革兰氏阳性菌的抗菌活性较对革兰氏阴性菌的活性强，且不同药物对不同种属的菌株活性差异较大，以石榴皮表现尤为明显，对金葡菌和产吲哚金黄杆菌在5味收涩药中活性最强，而对大肠埃希菌的活性又最弱，这也提示我们临床选用收涩药防治感染性疾病时，应针对具体病情及其感染病原的种类选用相对较为敏感的抗菌中药。此外，本研究还对收涩药五倍子的抗菌活性进行了研究，表明其抗菌活性均强于本文中受试的5味药；结合对清热药、解表药和化湿药等中药体外抗菌活性的系统比较研究，笔者发现以收涩类药物的体外抗菌活性最强，而关于收涩药防治奶牛乳腺炎的临床运用情况又是否如此，却有待于后续“收涩药体内抗菌活性及其防治奶牛乳房炎的临床疗效”等研究的深入探讨。

[1] 赵国平,戴真,陈仁寿.中药大辞典[M].2版.上海:上海科学技术出版社,2006:858-860.

[2] 杨丽平,杨永红.石榴皮的研究进展[J].云南中医中药杂志,2004,25(3):45-47.

[3] 王贵林,张昊.乌梅不同药用部位对豚鼠离体胆囊平滑肌的作用[J].长江大学学报：自然科学版,2008(5):6-8.

[4] 边才苗,杨云斌,费杰.五味子提取物体外抑菌作用初探[J].浙江中医药大学学报,2009,33(1):122-123.

[5] AIM M J.KIM C Y,LEE J S,et al.Inhibition of HTV-1 Integrase by Galloyl Glucoses from Terminalia Chebula and Flavonol Glycoside Gallates from Euphorbia Pekinensis[J].Planta Med,2002,68(5):457-459.

[6] PRASAD L,KHAN T H,JAHANGIR T.et al.Chemomodulatory Efects of Terminalia Chebula against Nickel Chloride Induced Oxidafive Stress and Tumor Promotion Response in Male Wistar Rats[J].J Trace Elem Med Biol,2006,20(4):233-239.

[7] 王军,张秀凤,宋予震,等.诃子粗提物影响家兔离体小肠运动的试验[J].中国兽医杂志,2010,46(1):17-19.

[8] GUO S,DENG Q,XIAO J,et al.Evaluation of Antioxidant Activity and Preventing DNA Damage Effect of Pomegranate Extracts by Chemiluminescence Method[J].J Agric Food Chem,2007,55(8):3 134-3 140.

[9] ZHANG Q,JIA D,YAO K.Antiliperoxidant Activity of Pomegranate Peel Extracts on Lard[J].J Nat Prod Res,2007,21(3):211-216.

[10] 徐真真,冯锦和,陆惠文,等.石榴皮提取物对小鼠氧化应激状念的改善作用[J].中药材,2008,31(8):1 193-1 196.

[11] 阮毅铭.乌梅的化学成份及药理作用概述[J].中国医药导刊,2008,10(5):794-795.

[12] 陈荣华,吴向阳,仰榴青,等.五味子醇提残渣中粗多糖的体外抗氧化活性研究[J].时珍国医国药,2009,20(6):1 512-1 513.

[13] WANG Y,LI Z Q,CHEN L R,et al.Antiviral Compounds and One New Iridoid Glycoside from Comus Officinalis[J].Progress in natural science,2006,16(2):142-146,

[14] 姚瑞芹,张丽,张兰,等.山茱萸环烯醚萜苷对局灶性脑缺血模型大鼠BDNF及其受体TrkB表达的影响[J].中国药理学通报,2009,25(11):1 535-1 536.

[15] 赵海智,李国玉,白天红.五味子果浆对乳酸菌生长的影响及五味子酸奶的加工[J].中国乳品工业,2003,31(4):28-30.

[16] 张艳萍,尤玉如,戴志远.山茱萸多糖体外清除自由基和抗氧化作用研究[J].中国食品学报,2008,8(6):18-22.

[17] 孙长贵译.抗微生物药物敏感性试验执行标准(第十六版信息)[M].2006,M100-S16.

[18] 李仲兴,王秀华,岳云升,等.诃子对335株临床菌株的体外抑菌活性的研究[J].中国中医药科技,2000,7(6):393-394.

[19] 刘东梅,毕建成,郄会卿,等.黄芩、黄连、乌梅、金银花、败酱草对产AmpC β-内酰胺酶细菌的体外抑菌作用[J].河北中医,2008,30(6):654-655.

[20] 李仲兴,王秀华,赵建宏,等.乌梅对308株临床菌株的抑菌效果[J].中国中医药信息杂志,2007,14(11):41-42.

[21] 陈雪珊,高晓黎.石榴皮提取液、浓缩液、冷干粉末及石榴皮软膏的体外抑菌试验[J].新疆医科大学学报,2009,32(5):565-567.

Comparative study on antibacterial activity in vitro of 5 kinds of astringent therapy herbs against pathogenic bacteria from dairy cow with mastitis

DAI Min1,2，PENG Cheng1，WAN Feng1，CHEN Dan-dan1
（1.State Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of TCM Resources,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China;2.Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China）

The agar dilution assay was used to test the minimal inhibitory concentration for 5 astringent therapy herbs to 120 strains pathogenic bacteria from dairy cow with mastitis.To compare antibacterial activity,one-factor analysis of variance(ANOVA),MIC50and MIC90were used for statistical analysis.The results showed that 5 astringent therapy drugs had strong antimicrobial activity against 120 clinical isolates from cows.And Terminalia chebula Rotz had strongest antibacterial effects;dark plum and pomegranate peel had higher antibacterial effects;Schisandra had high antibacterial effects;cornus officinalis had the lowest antibacterial activity.Furthermore,compared with gram-negitive germs,all drugs showed a strong antibacterial activity to gram-positive germs,and the experimental drug showed different antibacterial activity to different species of experimental bacteria.

in vitro antibacterial activity;astringent therapy herbs;pathogenic bacteria from mastitis

TS252.1

A

1001-2230（2011）02-0041-04

2010-10-12

国家“十一五”支撑重点项目（2009BAI84B04）。

代敏（1974—），女，副教授，主要从事抗菌中药的药效和毒理研究。

彭成