乳品真蛋白率的提出及测定

侯彩云，赵静，刘莹，王旭，黄昕

（中国农业大学功能乳品教育部北京市共建重点实验室，北京100083）

乳品真蛋白率的提出及测定

侯彩云，赵静，刘莹，王旭，黄昕

（中国农业大学功能乳品教育部北京市共建重点实验室，北京100083）

利用三氯乙酸-双缩脲比色法对添加乳清蛋白乳粉的蛋白质量分数进行测定。结果表明，乳清蛋白的加标回收率在89.2%～99%之间，重现性在0.26%～0.98%之间，表明三氯乙酸-双缩脲比色法可以较好地检测出乳中的真蛋白。提出了真蛋白率的概念，并测定出乳粉的真蛋白率范围在78.06%～89.90%之间；液态乳的真蛋白率范围在90.03%～96.25%之间。

三氯乙酸-双缩脲比色法；凯氏定氮法；蛋白质质量分数；真蛋白率

0 引言

蛋白质是乳品质量优劣的重要指标[1]。我国现行国家标准规定乳制品中蛋白质质量分数的测定方法为凯氏定氮法（简称K法）[2]。根据其测定原理，K法的测定值为样品中粗蛋白的质量分数[3]。正常情况下，乳粉中的非蛋白氮质量分数在总氮中所占比例是基本稳定的[4，5]。然而，一旦在样品中添加了非蛋白含氮物，就会对K法的测定结果产生影响。K法的这一漏洞曾经给一些不法厂商的制假售劣提供了可乘之机。

与粗蛋白相对，真蛋白质量分数可以较好地反映乳的真实营养价值[6]。为此，本研究室提出了一种三氯乙酸-双缩脲比色法（简称T+B法）[7]，在此基础上，提出了真蛋白率的概念，以期找到一种可以较为有效地排除包括尿素、三聚氰胺和水解蛋白在内的多种非蛋白含氮物对乳品中蛋白质量分数测定影响的方法，为鉴别非蛋白含氮物的非法添加提供必要的技术依据。

1 实验

1.1 材料

12种市购液态乳；15种市购乳粉。

酪蛋白标准品，牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）标准品，乳清蛋白（质量分数为60%），双缩脲试剂，四氯化碳，三氯乙酸，体积分数为95%乙醇。

双缩脲试剂：将浓度为10 mol/L氢氧化钾10 mL和质量浓度为250 g/L酒石酸钾钠溶液20 mL加到约800 mL蒸馏水中，剧烈搅拌，同时缓慢加入质量浓度为40 g/L的硫酸铜溶液30 mL，定容至1 000 mL。

硼酸-指示剂混合液：溴甲酚绿0.5 g，甲基红0.1 g溶解于体积分数为95%乙醇中，稀释至100 mL即为硼酸指示剂混合液。

催化剂：五水合硫酸铜10 g，硫酸钾100 g，在研钵中研磨，过40目筛。

浓度为0.01 mol/L盐酸标准溶液，质量分数为2%硼酸，质量分数为35%氢氧化钠，浓硫酸，亚甲基兰-甲基红指示剂。

1.2 仪器

分析天平，电子天平，752型分光光度计，高速冷冻离心机(GL220G2Ⅱ)，超声波清洗器(KQ1002DB)，消煮炉（KXL-1010），定氮仪（KDY-9820）。

1.3 方法

1.3.1 现行国标蛋白质测定方法

分别精确称取15种乳粉0.2000 g，编号为1～16，顺序加入0.5～0.55 g的催化剂，5 mL的浓硫酸，放在消煮炉上消化；消化完全并待样品冷却后，用凯氏定氮仪蒸馏，并用已标定的浓度为0.1 mol/L的盐酸滴定，计算得到样品蛋白质量分数。样品平行测定3次[8]。

分别精确称取12种液态乳1.5000 g，编号为1～12，顺序加入0.5～0.55 g的催化剂，5 mL的浓硫酸，放在消煮炉上消化；消化完全并待样品冷却后，用凯氏定氮仪蒸馏，并用已标定的浓度为0.2 mol/L的盐酸滴定，计算得到样品蛋白质量分数，记为Pk。样品平行测定3次[8]。

1.3.2 T+B法测定各种乳的蛋白质量分数

1.3.2.1 标准曲线的绘制

按表1加入酪蛋白标准品和双缩脲试剂，充分混匀。绘制酪蛋白标准曲线。样品平行测定3次。

表1 酪蛋白标准曲线的制作

1.3.2.2 样品蛋白质量分数的测定

精确称取乳粉0.2000 g，置于50 mL离心管中，加入2 mL水溶解均匀。加入15%三氯乙酸溶液5 mL混匀，静置10 min，10 000 r/min下离心10 min。弃去上清液，加入体积分数为95%无水乙醇10 mL混匀，10 000 r/min下离心5 min。弃去上清液，加入四氯化碳2 mL和双缩脲试剂20 mL，用超声波清洗器震荡均匀，使蛋白溶解，静置显色10 min，10 000 r/min下离心20 min。以0管调零，540 nm下测定表1配制的标准溶液的吸光度值。以各管真蛋白浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。同时测定上述提取蛋白液的吸光度值，并根据标准曲线的线性回归方程读取试液的真蛋白质量浓度c。样品平行测定3次。

精确称取液态乳1.5000 g，置于50 mL离心管中。加入质量分数为15%三氯乙酸溶液5 mL混匀，静置10 min，10 000 r/min下离心10 min。弃去上清液，加入体积分数为95%无水乙醇10 mL混匀，10 000 r/min下离心5 min。弃去上清液，加入四氯化碳2 mL和双缩脲试剂20 mL，用超声波清洗器震荡均匀，使蛋白溶解，静置显色10 min，10 000 r/min下离心20 min。以0管调零，540 nm下测定表1配制的标准溶液的吸光度值。以各管真蛋白浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。同时测定上述提取蛋白液的吸光度值，并根据标准曲线的线性回归方程读取试液的真蛋白质量浓度c。样品平行测定3次[7]。

按下式计算乳品试样的蛋白质量分数P0：

式中：P0为乳品中真蛋白的质量分数；c为试液蛋白质量浓度；m0为取样量。

1.3.2.3 乳清蛋白的添加对T+B法测定结果的影响

精确称取乳粉0.2000 g 7份，编号为1-7；按照表2所示分别向其中7份添加乳清蛋白，置于50 mL离心管中，加入2 mL水溶解均匀。加入15%三氯乙酸溶液5 mL混匀，静置10 min，10000 r/min下离心10 min。弃去上清液，加入95%无水乙醇10 mL混匀，10000 r/min下离心5 min。弃去上清液，加入四氯化碳2 mL和双缩脲试剂20 mL，用超声波清洗器震荡均匀，使蛋白溶解，静置显色10 min，10 000 r/min下离心20 min。以0管调零，540 nm下测定表1配制的标准溶液的吸光度值。以各管真蛋白浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。同时测定上述提取蛋白液的吸光度值，并根据标准曲线的线性回归方程读取试液的真蛋白质量浓度c。样品平行测定3次。按1.3.2.2中的公式计算P0。

表2 乳粉中添加乳清蛋白的配制

1.3.3 乳品真蛋白率的提出与计算

按下式计算三氯乙酸-双缩脲法（T+B法）和凯氏定氮法所测定乳品蛋白质量浓度的比率，记为δP，该值称为真蛋白率，表示乳品中真实的蛋白质量分数在粗蛋白质量分数中所占的比率。

式中：δP为真蛋白率；P0为真蛋白的质量分数；Pk为样品中粗蛋白的质量分数。

2 结果与讨论

2.1 T+B法测定样品蛋白质量分数

2.1.1 乳清蛋白的添加对T+B法测定乳粉蛋白质量分数的影响

图1是不同添加量的乳清蛋白对乳粉的蛋白质量分数的影响。可以看出，随着乳清蛋白添加量的增加，乳粉的蛋白质量分数也相应增加，表明T+B法测定乳粉的蛋白质量分数时，乳清蛋白被三氯乙酸沉淀了，并且乳清蛋白和酪蛋白一起与双缩脲试剂发生显色反应。

图1 乳粉的蛋白质量分数

2.1.2T+B法测定乳粉蛋白质量分数时乳清蛋白的回收率和重现性

通过加入乳清蛋白进行定性，可以检测到乳清蛋白的加标回收率在89.2%～99%之间，重现性在0.26%～0.98%之间。说明T+B法测定添加乳清蛋白的乳粉的蛋白质量分数时，乳清蛋白可以被较好的定量检测出来。

2.2 两种方法测定结果的比较

表3和表4为凯氏定氮法和T+B法分别测定的12种液态乳和15种乳粉的蛋白质量分数。

表3 12种液态乳的蛋白质量分数%

表4 15种乳粉的蛋白质量分数%

由表3和表4可以看出，凯氏定氮法和T+B法测定的乳粉和液态乳的蛋白质量分数具有一致性。通过成对t检验，|t|＜t(0.05,n)(n=12,15)，说明T+B法与凯氏定氮法测定乳粉和液态乳蛋白质量分数时，两者不存在显著性的差异。

2.3 乳品真蛋白率的测定与分析

图2和图3分别是液态乳和乳粉的真蛋白率测定结果。由图2可以看出，液态乳的真蛋白率范围在90.03%～96.25%之间，表明液态乳中非蛋白含氮物在粗蛋白中所占的比例并非定值，可能会因各种因素的影响，在一定的范围内有所波动。由图3可以看出，乳粉的真蛋白率范围在78.06%～89.90%之间，表明乳粉的真蛋白率普遍低于液态乳。之所以如此，一方面可能是因为加工工艺的需要，另一方面也可能是存在人为添加非蛋白含氮物的结果。与粗蛋白相比，真蛋白可以更加直观地反映乳品的真实营养价值。对于市售乳品而言，真蛋白率应该稳定在一定的范围内。如果某种乳品的真蛋白率过低，表明有可能存在人为添加外源含氮物质的情况，应通过对其中的乳蛋白甚至氨基酸的构成进行进一步分析的方式，以确认其质量是否名实相符。

图2 液态乳的真蛋白率

图3 乳粉的真蛋白率

3 结论

利用T+B法对添加乳清蛋白乳粉的蛋白质量分数进行测定时，乳清蛋白的加标回收率在89.2%～99%之间，重现性在0.26%～0.98%之间，重现性较好，表明T+B法可以较好地检测出乳中的真蛋白。

凯氏定氮法和T+B法测定乳品的蛋白质量分数具有一致性。提出了真蛋白率的概念，对于不同乳品而言，真蛋白率应稳定在一定的范围内，如果某种乳品的真蛋白率测定值与其合理的范围偏差过大，则说明该乳品可能存在人为添加非蛋白含氮物的情况。对所收集样品的测定，表明乳粉的真蛋白率在78.06%～89.90%之间；液态乳的真蛋白率在90.03%～96.25%之间。

[1] 程涛，孙艳波，李健.双缩脲法测定乳中酪蛋白含量[J].中国乳品工业，2000，28(3)：33-35.

[2] 食品安全国家标准.GB 5009.5-2010，食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[3] 盛成乐.关于凯氏定氮法测定蛋白质的几个问题[J].中国酿造，2002（2）：43-44.

[4]武健新.牛乳蛋白质的性质及应用[J].中国乳品工业，1997，25（2）：18-21.

[5] 陈靖，侯彩云，牛巍，等.乳粉蛋白氮数字图像检测方法的研究[J].食品科技，2007(9)：210-212.

[6] 刘东红，唐佳妮，吕元，等.乳品真蛋白—定义、分析方法、计价及影响因素[J].中国食品学报，2008，8（5）：115-119.

[7] 侯彩云，王加启，刘凤岩，等.NY/T1678-2008，乳与乳制品中蛋白质的测定双缩脲比色法[S].北京：中国标准出版社，2008.

Determination on the ratio of true protein in milk products

HOU Cai-yun,ZHAO Jing,LIU Ying,WANG Xu,HUANG Xin
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

The protein content is determined by trichloroacetic acid－biuret method in milk powder.The recovery of whey protein is 89.2%～99%and the detection limit is 0.26%～0.98%,which shows the true protein can be well determined by trichloroacetic acid－biuret method.The concept of true protein ratio is proposed,and the true protein ratio in the milk powder and raw milk is 78.06%～89.90%and 90.03%～96.25%respectively.

trichloroacetic acid-biuret method；Kjeldahl nitrogen method；the protein content；true protein ratio

TS252.1，TS252.7

A

1001-2230（2011）02-0056-03

2010-11-15

农业科技成果转化资金项目（2009GB23600525）。

侯彩云（1963-），女，教授，从事食品质量安全方面的研究。