硅藻定量检验和种属鉴定的实验研究

杨丽

摘要：硅藻检验在诊断溺死方面是一种相对可靠的方法。本文简述了硅藻检验在死因诊断中的应用，通过对其检验方法进行优缺点的探讨，对检验中的问题以及发展的方向进行了分析，以期对鉴定溺死提供借鉴。

关键词：硅藻;溺死;检验;种属

藻检验可以为尸体死因以及死亡的方式提供有力的依据，是当前诊断溺死的一个重要的检验方法，在对污染进行了严格控制的前提下，硅藻检验可以作为诊断溺死的金标准[1-2]。

1硅藻的生物学特征

硅藻属于单细胞藻类，在自然界的水域中广泛存在。硅藻种类繁多，各种藻类在水体中的分布会随着环境的不同呈现出种群上的差异，同时还会受到温度、季节以及光照等因素的影响。硅藻细胞的直径一般为1-600μm之间，体积差异非常明显。硅藻相对于其他藻类，有其自身的特殊性：首先是硅藻体外有一层硅质壳，是由果胶和硅质组成，由细胞壁硅质化生成;其次是不同种类的硅藻有不同的标志性特点，可以依据硅藻形态及纹饰上的区别来对其进行区分[3-4]。

2硅藻的检验方法

目前在硅藻检验时，其方法可以大致分成三个类型，即化学元素法、消化法和DNA检测法。

2.1化学元素法

这种方法采用紫外线的方式，激发硅藻体内的叶绿素a产生出一定量的荧光，由此计算出浮游生物的总体含量。这种检测方法成本低，对环境等的污染比较小，且操作非常简单。

2.2无机消化法

在早期对硅藻进行检测有一系列方法，例如有离心法、浸渍法、焚烧法等，而1937年由Kasparek创建的浓硝酸法则成为了无机消化法的基础。在此基础上，又出现了许多新的检测方法，例如，采用微波加热和可以控制压力的消解罐可以组成微波消解仪，研发人员由此研发了微波消解扫描电镜联用法，这种方法能够让有机物能够更好地被消解，对于硅藻检出率有了较大的提高，得到了广泛地使用。但是这种检验的成本是比较高的，检验的周期较长，对于技术人员的专业技能要求较高，难以在基层进行推广和应用。王玉仲等[5]对此方法进行了优化，将滤膜透明化，即可在普通的显微镜下来观察硅藻，让检测成本大幅下降。

2.3有机消化法

有机消化法在检测的过程中对于硅藻的破坏较小，可以保留硅藻的核酸物质，后期可以对硅藻进行各项分子生物学方面的检测，但是其消化环节还需要进行进一步的优化。有机消化的方式有两种：一是适用于检测淡水中硅藻的Soluene-350法，同时添加超声波加热的环节能够将试验时间缩短;二是利用酶来进行消化的方法，其方法在检测过程中采用了SDS和蛋白酶K来对组织进行酶消化，能够检测出样品当中的硅藻和一些浮游生物，同时不会对硅藻进行较大程度的破坏。

2.4分子生物学检验方法

何方钢等[6]研究表明，对硅藻的16SrDNA进行检测，能够为案件中溺死的地点提供重要的依据;zhao等[7]利用对硅藻18SrDNA的部分区域进行测序，进而对硅藻进行分类，为工作人员判断溺水者的溺水位置提供依据;采用PCR-DHPLC法来对硅藻进行检测，能够确定硅藻的种类，与消化检测法相比，其检出率更高，同时对于样品量的需求更低。

rbcL基因是控制叶绿体进行光合作用的关键基因，因此检测rbcL基因在推断溺死地点的工作中也有较好的开发前景。Kathleen[8]等针对rbcLjiyin 开发了相关引物，检测出了许多找见的硅藻。

3检测中存在的问题及展望

3.1硅藻种属的判断

将消化检测法和对硅藻进行形态学上的观测进行结合，就能够对硅藻的具体种类进行判断。但是消化法在检测过程中会对后续的形体观察造成一定程度的影响。例如在进行无机消化的过程中，会对硅藻的具体形态造成破坏，而有机消化则可能会对样品的消化不完全，导致一些硅藻被掩藏而遗漏这部分硅藻。

3.2硅藻的定量检测

在具体的检测过程中，尸体的各个器官中硅藻含量的检测对于溺死的定性来说非常关键，但是目前实行的检测在实际工作中存在一些困难。例如在消化法中，由于无机消化的过程造成了硅藻的破坏，一些破碎的硅藻难以被统计，同时若采用肉眼观察的方法，则可能会产生人为误差，对于硅藻数量的統计会与真实值产生一定的差异。而在有机消化的过程中对样品的消化不完全，因此在进行数量统计时可能会造成遗漏。如何在保证硅藻形态完整性的情况下建立起扫描统计将成为后续发展的方向。

3.3硅藻的DNA检测方法

分子生物学检测在未来有着良好的发展前景：首先目前对于硅藻的检测大部分是检测共性DNA，下一步可以开发种属特异性的检测方法;其次由于溺死的尸体中DNA可能会降解，因此改良硅藻DNA提取和纯化的发展，提高DNA的检出率也是将来的发展方向。

4小结

硅藻检验在应用中有非常大的意义，目前这种方法检测的成本较高，对于专业技术人员的要求高，检验时间较长，且存在检验的方法不成熟，造成环境污染等问题，但是这种方法已经成为相关部门的一种重要检测方法，能够为案件的侦办提供证据和线索，因此后续需要对这种检测技术进行优化和完善。

参考文献：

[1]. 小泉格， 王开发与郭蓄民， 硅藻. 1984： 地质出版社.

[2]. 王玉仲，赵建，李鹏，等. 三种硅藻检验方法比较[J]. 南方医科大学学报，2015，35（3）：427-431.

[3] 何方刚，黄代新，刘良，等 .PCR-DGGE 法检测浮游生物16S rDNA 在溺死鉴定中的应用[J]. 中国法医学杂志， 2008（4）：234-237.

课题项目：2020年度校级中青年科研基金项目，安徽省内长江流域硅藻分布及其变化规律的研究（课题编号WK202004）F25EF4B3-26D4-4962-84E2-F4964BD4C901