鸡胚尿囊膜(HET-CAM)眼刺激替代试验对产品及原料评价的比较

邱 璐，李小林，卞俐娜，山口能宏

(1.上海出入境检验检疫局，上海 200135;2.日本小林制药株式会社，大阪)

鸡胚尿囊膜(HET-CAM)眼刺激替代试验对产品及原料评价的比较

邱 璐1，李小林1，卞俐娜1，山口能宏2

(1.上海出入境检验检疫局，上海 200135;2.日本小林制药株式会社，大阪)

目的 比较鸡胚尿囊膜试验(HET-CAM)作为一种眼刺激替代方法对产品或原料的评价。方法采用HET-CAM和兔眼Draize试验方法，对19种原料和23种化妆品及家用洗涤产品眼刺激性进行检测，对体内体外试验的结果进行统计比较。结果 比较体内体外试验，原料和产品的kappa系数分别为0.826，0.531;灵敏度分别为100%，81.8%;特异度分别为85.7%，77.8%。结论 HET-CAM可作为Draize试验的替代试验，HET-CAM系统更适合对单纯化学品原料进行眼刺激试验。

鸡胚尿囊膜试验;Draize眼刺激试验;替代试验

眼刺激试验是化妆品安全性评价的重要指标，一般采用Draize［1］眼刺激试验进行评价，经济合作和发展组织(OECD)将这个方法纳入了指南［2］。我国化妆品卫生规范［3］中眼刺激试验基本参照了OECD指南的方法。2009年3月，欧盟已禁止使用动物进行安全性试验的化妆品及原料的销售，虽然美国、日本等发达国家还没有颁布类似的法规，但都已设立了相关的替代试验验证中心，鼓励并开展毒理替代法的研究和验证。我国是化妆品生产和进出口大国，从顺应国际趋势和应对贸易壁垒的角度，加紧研究和实施替代试验工作是迫在眉睫的。目前国际上对眼刺激替代方法的研究非常多，近20年间完成的替代验证评估也较多，这些方法主要基于以下几个方面，以细胞系为对象的试验，以离体眼为对象的试验，体外人工组织学模型，HET-CAM试验，计算机模拟(QSAR)试验，减量眼刺激(LVET)试验等，迄今，牛眼角膜通透性试验(BCOP)和离体鸡眼试验(ICE)已被OECD接受为指南［4，5］，欧洲 替 代 验 证 中心 (ECVAM) 对 包 括HET-CAM试验在内的较多的眼刺激替代方法完成了验证评估，此方法在国外已较多采用。鸡胚尿囊膜表面血管丰富，可以看作一个完整的生物体，不像单纯在细胞系上进行的试验，在作为眼刺激替代方法上有较好的潜力。本研究选用了一定数量的原料和产品，参照 ECVAM推荐的 HET-CAM方法［6，7］进行测试，比较此方法对产品和原料眼刺激评估的优劣。

1 材料

1.1 受试产品及原料

受试产品23份，大部分为化妆品，9份来源于本室进口化妆品检验样余，14份购自上海家乐福超市(包括5份家用洗涤产品)。受试化学物19份，大部分为化妆品原料，均购自日本，其中14份购自日本WAKO公司，3份购自日本MPBio公司，2份购自日本TCI公司。

1.2 SPF受精鸡胚

种蛋购自北京梅里亚维通公司。重量50 g～60 g，在本室孵化，于第9天龄开始试验。

1.3 孵化箱

美国KUHL AZYSS-600-220，孵化温度37.5℃ ±0.5℃，相对湿度55% ～70%，翻蛋频率3～6次/h。体式显微镜(德国蔡司 ZEISS Discovery V20)，采用冷光源。

1.4 其他

照蛋器(自制)，眼科弯头小镊，微量加样器，计时器，无菌生理盐水。

2 方法

2.1 鸡胚准备

在试验开始前一天，照蛋检查，弃死蛋，选取血管发育良好的鸡胚，在蛋壳表面标记气室位置。试验开始时，用镊子在气室表面轻磕一小孔，然后小心剥去带标记的蛋壳部分，保证白色蛋膜的完整。在蛋膜表面滴几滴生理盐水湿润，顷出，用镊子仔细将蛋膜取下，保证暴露的尿囊膜完整不受任何损伤。每处理好一只鸡胚即开始试验，完成后再处理下一只鸡胚。尽量缩短鸡胚在非孵化条件下存留的时间。每个试验组使用鸡胚6只。

2.2 样品干预

无论样本物理性状如何，均无需前处理直接进行干预。如果为透明液体物质，则取0.3 mL直接滴加在尿囊膜上，尽量覆盖表面并开始记时，观察膜反应情况，并记录。最长观察时间5 min(时间评价法)。如果样本为固体微粒(较大颗粒物在干预前尽量研磨成粉末状)、膏状或浑浊液体，直接称取约0.3 g用于尿囊膜，尽量涂布开，至少覆盖50%膜表面，开始计时，至3 min停止，用生理盐水轻轻冲洗膜表面，顷出液体，然后在显微镜下进行观察(终点评价法)。

2.3 刺激效应

2.3.1 出血：血液从血管或毛细血管流出。根据无出血、轻度出血、中度出血、重度出血分别判予0、1、2、3 分。

2.3.2 凝血：血管内外蛋白变性，可表现为血栓、管壁肿胀、血管内外的凝血点出现、管外乳浊样浑浊等状况。根据无凝血、轻度凝血、中度凝血、中度凝血分别判予 0、1、2、3 分。

2.3.3 血管融解：膜上血管消融。根据无血管融解、轻度血管融解、中度血管融解、中度血管融解分别判予 0、1、2、3 分。

2.4 结果观察

观察并记录试验开始到每一种刺激效应出现的时间，精确到秒(时间评价法)。

观察并记录试验开始到每一种刺激效应发生的程度(终点评价法)。

2.5 结果评估

2.5.1 时间评价法：应用公式计算刺激评分(IS)

表1 时间评估法结果评价Tab.1 Evaluation by reaction time method

2.5.2 终点评价法：计算终点评分(ES)

ES=6只鸡胚观察到出血、凝血和血管融解的时间总和

2.5.3 试验参照物：每次试验应带0.9%生理盐水作为阴性对照，IS值应为0;使用1%SDS和 0.1 mol/L NaOH作为阳性对照，IS值应在10～19之间。

表2 终点评估法结果评价Tab.2 Evaluation by end-point assesment

2.6 Draize兔眼刺激试验

原料刺激试验采用《化妆品卫生规范》(2007版)［3］进行，产品的动物试验结果采用我室历史数据。

2.7 统计

将兔眼刺激试验和HET-CAM眼刺激试验的分级结果用 SPSS 11.0软件进行相关性分析，得到Kappa系数，判断两种试验结果的一致性情况。

3 结果

3.1 产品兔眼Draize试验和HET-CAM试验比较

在进行的23种不同种类产品(表3)的测试中，将Draize试验结果作为标准进行比较，两者的一致性达73.9%，灵敏度和特异度分别为85.7%和77.8%(表4)。用 SPSS统计软件分析Kappa系数为0.531，显示一致性为一般。

表3 产品Draize和HET-CAM试验结果Tab.3 The result of Draize and HET-CAM for Products

表4 产品Draize试验和HET-CAM试验分级结果Tab.4 The result of classification of two tests for products

3.2 原料兔眼Draize试验和HET-CAM试验比较

在对19种化妆品原料的检测中，同样与Draize结果比较，两者的一致性达89.5%，灵敏度和特异度分别为100%和81.8%(表5)。用 SPSS统计软件分析的Kappa系数为0.826，显示一致性为优秀。

表5 原料Draize和HET-CAM试验结果Tab.5 The result of Draize and HET-CAM for ingredients

4 讨论

在对产品和化学品(原料)的安全性的评估中，长期以来眼刺激试验都是采用使用实验动物的Draize试验进行，由于兔子没有泪腺，所以选用兔子为受试对象，一些具有强刺激性的样品会给动物造成了极大的痛苦。由于近年来动物保护呼声的高涨以及3R概念在国家社会被广泛接受，世界各国对毒理试验动物替代方法的研究日益重视，毒理学试验乃至一些基础医学研究中动物试验被替代将成为一种趋势。欧盟出台的禁止动物试验的化妆品指令已在2009年3月开始实施，虽然生殖毒性、慢性毒性、毒代动力学试验替代试验的实施相应会延长，但眼刺激试验已被禁止在动物身上进行。目前，欧洲替代法验证中心(ECVAM)的数据库中大约有近70种眼刺激替代方法，并提供了30余种方法的操作步骤，大约有10多种方法已完成了验证研究的步骤，评估审核报告对每一种方法的适应性、使用前景及存在的问题进行了概括。HET-CAM鉴别强刺激物和测试眼腐蚀性能力试验的验证研究在2003～2006年之间由 ICCVAM-NICEATM(美国替代方法验证统筹委员会-美国国家毒理替代评估项目中心)与 ECVAM合作完成，同时进行的还有BCOP、ICE以及 IRE(离体兔眼)试验，2006年 11月，NICEATM发布了对这四种方法鉴别强刺激物或进行腐蚀性试验的推荐，2009年9月，BCOP和ICE试验被OECD正式接收为 TG437和 TG438，允许其单独作为检测眼腐蚀性和鉴别强刺激物的试验，而无需进行其他的动物试验。2009年5月，ICCVAM还评估了以上四个以器官特征为对象的替代方法在检测温和或非刺激性物质试验中的可行性，ICCVAM Ocular Peer Review Panel(ICCVAM眼刺激同行评议专家小组)仍推荐BCOP作为这个目的试验的方法(还未正式发布)，对HET-CAM试验，专家小组认为，由于选取的温和到中等刺激范围的受试物数量偏低，虽然对EU(欧盟)和GHS(全球化学品统一分类和标签制度)系统中化学物的分类情况较好，但还需要更多数量不同物理化学特性的、分级覆盖面更广的样本数据支持才可以推荐其作为鉴别无或温和刺激物的试验［8］。虽然目前 BCOP和ICE已成为OECD标准指南试验，但离体眼球在有些地区来源渠道存在问题，需要的特殊装置生产厂家很少，在中国较难购置，所以使用受到一定的限制。另外的一些眼刺激替代方法，相当数量是以细胞系的毒性反应为基础进行的，这类方法重复性好，敏感性高、通量大，简便易行，但由于缺乏代谢体系，与体内试验的一致性还不高，只适用于某些类型的样本［9］，也可以作为系列试验中作为筛选试验使用，不适合作为单独的眼刺激评价方法。HETCAM试验在鸡胚上进行，鸡胚可以看成一个独立的生物体，所以HET-CAM试验可以认为是一个是整体试验，同时符合3R替代原则。另外，此试验条件简单，材料易于获取，方法易于掌握，虽然目前在国际上作为独立的标准替代方法还需要完善一定的验证试验，但前景很好。为了探索HET-CAM试验系统是否适合原料和产品的眼刺激评估，我们选取了一定有代表性的产品和原料进行测试。结果表明，该系统非常适合于评价化学品原料的刺激反应，从Kappa系数和一致率均表明与动物试验的一致性非常优良，并且敏感性相当高，假阴性率为0%，结果亦表明该试验敏感于动物试验。在对产品的测试中，体内体外试验的一致性表现得相对较低，为73.9%，但 Kappa检验结果仍表明有相当的一致性。同时，对产品的结果表现出14.3%的假阴性率，而原料的假阴性率为0%，这可能源于产品内成分产生的叠加或削减效应。另外，图1和图2显示在HET-CAM试验中，样本对鸡胚尿囊膜表现出的明显损伤，但在相应的动物试验中，刺激性表现的较小，这表明HET-CAM试验对刺激的判断强于动物试验，所以该试验应该可以较好地鉴别强刺激物，与NICEATM推荐一致。在对 Draize试验中等刺激物的试验中，产品检测结果 HET-CAM试验强于动物试验，而原料的检测结果与动物试验一致。总体上，本试验的结果预示了HET-CAM与其他体外试验一样，其敏感性高于动物试验，这与杨光宇［10］等人的结果不一，在他们的结果中，HET-CAM试验将动物试验判定为强刺激的12种产品中的5份样品检测为中等强度刺激物，本试验中动物试验判断为强刺激物的12种样品，HET-CAM试验结果也均为强刺激。张宏伟［11］和廖艳［12］等人利用HET-CAM试验进行了化妆品和化学品的检测，均得

出HET-CAM可以作为Draize替代试验的结论，与本试验的结论一致，他们得到的产品和原料的体内外试验的相关系数均非常高，而本试验的统计结果说明，HET-CAM试验可能更适合于对化学品原料进行眼刺激评估。

表6 原料 Draize试验和HET-CAM试验分级结果Tab.6 The result of classification of two tests for ingredients

HET-CM图例见彩插3图1和图2。

［1］ Draize JH，Woodard G，Calvery HO，et al.Method for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes［J］.Pharmacol Exp Ther，1944，82：377-390.

［2］ OECDGuidelines for the Testing of Chemicals，Test No.405：Acute Eye irritation/Corrosion

［3］ 中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范，2007：112-115.

［4］ OECD Guidelines for the Testing of Chemicals，Test No.437：Bovine CornealOpacity and Permeability TestMethod for Identifying Ocular Corrosive and Severe Irritants.

［5］ OECD Guidelines for the Testing of Chemicals，Test No.438：Isolated Chicken Eye Test method for Identifying Ocular Corrosive and Severe Irritants.

［6］ ECVAM DB-ALM：INVITTOX protocol n°96.

［7］ ECVAM DB-ALM：INVITTOX protocol n°47.

［8］ http：//iccvam.niehs.nih.gov

［9］ 邱璐，李小林，刘俊平，等.化妆品SIRC细胞短时暴露法试验［J］.毒理学杂志，2008，22(6)：473-476.

［10］ 杨光宇，杨颖，杨杏芬，等.鸡胚尿囊膜绒毛膜试验替代兔眼刺激试验的研究［J］.毒理学杂志，2006，20(6)：402-405.

［11］ 廖艳，王雪，张立实，等.受精鸡卵尿囊膜试验作为眼刺激试验替代方法的研究［J］.卫生研究，2004，33(3)：279-283.

［12］ 张宏伟，阮鸿洁，赵月朝.鸡胚尿囊绒膜试验检测化妆品的刺激性［J］.中国公共卫生，2004，20(10)：1213-1214.

Comparison of HET-CAM Eye Irritation Test for Products and Ingredients

QIU Lu1，LI Xiao-lin1，BIAN Li-na1，YOSHIHIRO Yamaguchi.2
(1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the P.R.C，Shanghai 200135，China;2.KOBAYASHI Pharmaceutical Co.，Ltd.，Osaka 567-0057，Japan)

Objective To compare the adaptability of HET-CAM eye irritation test for products and ingredients.Methods Test 19 ingredients and 23 products by HET-CAM and Draize eye irritation protocol.Compare the data from in vitro and in vivo test.Result Compare in vitro data and in vivo data，The Kappa coefficient，sensitivity，specificity are 0.826，100% ，85.75 for ingredient.0.531，81.8% ，77.8%for cosmetics as well.Conclusion HET-CAM eye irritation test can be used to be alternative test of Draize test.HET-CAM system is more suitable for ingredients test.

HET-CAM tset;Draize eye irritation test;Alternatives

R185 R332

A

1671-7856(2011)03-0027-04

2010-08-10

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.007

邱璐(1967-)，女，高级兽医师。研究方向：毒理学替代试验。