急性肺损伤大鼠肺组织基质金属蛋白酶2及其抑制因子蛋白和mRNA的表达

阮 琼，苏中昊，杨爱东，李文雯，汪东颖，吴中华，庞慧芳

(1.上海市第八人民医院急诊内科，上海 200233;2.上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

急性肺损伤大鼠肺组织基质金属蛋白酶2及其抑制因子蛋白和mRNA的表达

阮 琼1，苏中昊2，杨爱东2，李文雯2，汪东颖2，吴中华2，庞慧芳2

(1.上海市第八人民医院急诊内科，上海 200233;2.上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

目的 探讨内毒素致急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织核转录因子-κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及其抑制因子(TIMP-2)蛋白和mRNA表达的变化。方法 20只雄性Wistar大鼠随机分为2组：对照组、LPS模型组，每组再分为4 h和8 h两个亚组。尾静脉注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg)建立大鼠急性肺损伤模型。检测血白细胞计数、支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量，采用免疫组化ABC法和实时荧光定量PCR分别测定肺组织NF-κB、MMP-2、TIMP-2蛋白及其mRNA的表达，并观察肺组织病理变化。结果 与对照组相比，模型组4 h和8 h时大鼠肺组织中的NF-κB、MMP-2蛋白染色阳性面积率及其 mRNA表达均显著增高(P＜0.01)、TIMP-2蛋白染色阳性面积率及其mRNA表达均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。病理学观察显示，模型组大鼠肺组织出现出血及坏死。结论 内毒素致急性肺损伤的发病机制可能与NF-κB、MMP-2蛋白及其mRNA表达升高、TIMP-2蛋白及其mRNA表达降低有关。

脂多糖;急性肺损伤;NF-κB;MMP-2;TIMP-2

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭，以呼吸困难、难治性低氧血症和非心源性肺水肿为临床特征，严重的ALI或ALI的最终严重阶段被定义为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)［1］，研究表明，核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及其抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP-2)在内毒素致急性肺损伤的发病中有重要作用。本实验通过建立内毒素致ALI模型，观察大鼠肺组织 NF-κB、MMP-2、TIMP-2蛋白及其 mRMA表达的变化，为揭示急性肺损伤的发病机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级Wistar雄性大鼠20只，体重(220±20)g，由上海中医药大学实验动物中心提供［SCXK(沪)2007-005］。专用标准颗粒饲料、水喂养。

1.2 主要试剂

LPS：购自美国 Sigma 公司(LPS：O111：B4，批号 L-2630);NF-κBp65(NLS)：sc-114 购自美国 Santa Cruz生物技术公司;大鼠MMP-2和TIMP-2免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;大鼠 NF-κB、MMP-2、TIMP-2和GAPDH引物和探针序列由广州达辉生物技术有限公司合成，序列分别为：NF-κB：上游引物：5′-CTACACCGAAGCAATTGAAGTGA-3，下 游 引物：5′-CAGCGAGTGGGCCTGAGA-3，探针序列：5′-AGGCAGCCTCCAGCCCAGTGA-3，5′端 FAM 修饰;3′端 Tamra 修饰;MMP-2：上游引物： 5′-CCC ATG AAG CCT TGT TTA CCA-3′，下 游 引 物：5′-TGG AAG CGG AAC GGA AAC T-3′，探 针 序 列：5′-TGGCAATGCTGATGGACAGCC-3′，5′端 FAM 修饰，3′端 Tamra 修饰;TIMP-2：上游引物：5′-CTC ATC GCG GGC CGT TTA AG-3，下游引物：5′-GAA GGC TTC GGG TCA TCG AG-3′，探 针 序 列：5′-CATGGAGAGCCTCTGTGGAT-3′，5′端 FAM 修饰，3′端 Tamra 修饰;GAPDH：上游引物：5′-CCG AGG GCC CAC TAA AGG-3，下 游引物：5′-GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC AA – 3，探针序列：5′-CATCCTGGGCTACACTGAGGACCA-3，5′端 FAM 修饰，3′端Tamra修饰。Trizol总 RNA提取试剂、反转录和PCR扩增所需的酶及其他试剂均购自美国Invitrogen公司。

1.3 动物模型与分组

按随机数字表将大鼠随机分为对照组、模型组，再随机分为4 h、8 h两个亚组(每组5只)。模型组经尾静脉注射LPS(10 mg/kg)复制急性肺损伤大鼠模型［2，3］，正常组注入等容积生理盐水。

1.4 动物标本制备

所有动物均于设定的相应时相点(造模后4 h和8 h)，用乌拉坦1.0 g/kg腹腔麻醉，分离大鼠腹主动脉，取一次性5 mL注射器从大鼠下腔静脉抽取静脉血约1 mL注入肝素钠抗凝管中，混匀后进行白细胞计数检测。取血后解剖大鼠颈部，暴露气管，抽取生理盐水灌洗支气管，取离心后的支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)，用考马斯亮兰法测定蛋白浓度;开胸分离右肺上叶用10%甲醛溶液固定，用于病理检测及肺组织NF-kB、MMP-2和TIMP-2蛋白免疫组化检测;右肺下叶置于液氮罐中作 NF-kBmRNA、MMP-2mRNA和 TIMP-2mRNA表达检测。

1.5 免疫组织法检测肺组织 NF-κBp65、MMP-2及TIMP-2蛋白含量

采用IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件，对免疫组织化学结果进行图像采集和定量分析。每张切片在高倍镜下随机选择不相重叠的3个视野，细胞核为蓝色，NF-κBp65、MMP-2及 TIMP-2阳性细胞为棕黄色。计算出每例样本的蛋白染色阳性面积率(蛋白染色阳性面积率 =阳性细胞面积/总面积)作为比较参数。

1.6 实时荧光定量PCR检测肺组织NF-κBmRNA、MMP-2mRNA及TIMP-2mRNA的表达

按Trizol法提取总RNA后，逆转录合成 cDNA，在20 μL的反应体系中分别加入样本RNA2 μg全文统一，RT buffer(5 × )4 μL，10mmoldNTPs 1 μL，N9 随机引物 1 μL，逆转录酶 MMLV 1 μL，RNA 酶抑制剂1 μL，0.1 mol/LDTT2 μL，加 DEPC 处理水到 20 μL，混匀后于下列温度反应：37℃1 h;95℃5 min，灭活MMLV，产物即为cDNA。PCR扩增：在50 μL反应体系中加入 cDNA 5 μL，ddH2O 水 32 μL，PCR buffer(5 × )10 μL，荧光探针 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，dNTPs 0.5 μL，TNF-α 上下游引物各0.5 μL，扩增条件：(1)93℃ 2 min(2)93℃ 45 s 55℃ 1 min，10 cycle(3)93℃ 30 s，55℃ 45 s，30 cycle。

扩增产物分析：数据采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析。NF-κBmRNA、MMP-2 mRNA及TIMP-2mRNA表达水平以它们与GAPDH的相对表达量来计算。

1.7 肺组织病理学观察

制备肺组织标本，常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理改变。

1.8 统计学处理

采用SPSS13.0软件包分析统计，所有数据均采用均数±标准差(±s)表示，多组均数采用单因素方差分析，组间两两比较用 LSD检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血白细胞计数及支气管肺泡灌洗液蛋白含量比较

与对照组相比，模型组4 h和8 h时白细胞计数明显降低(P＜0.05或 P＜0.01)，肺泡灌洗液的蛋白含量明显升高(P＜0.01)。(见表1)

表1 两组大鼠血白细胞计数及支气管肺泡灌洗液蛋白含量比较 (n=5)Tab.1 Comparison of blood white blood cell count and protein content in BALF between the two groups(n=5)

2.2 大鼠肺组织NF-κB、MMP-2及 TIMP-2蛋白染色阳性面积率的比较

与对照组相比，模型组 4 h和 8 h时 NF-κB P65、MMP-2蛋白染色阳性面积率均明显升高(P ＜0.01);TIMP-2蛋白染色阳性面积率明显降低(P＜0.01)(见表2)。

表2 两组大鼠肺组织NF-κB、MMP-2及TIMP-2蛋白染色阳性面积率的比较 (n=5)Tab.2 Comparison of expression of NF-κB ，MMP-2 and TIMP-2 protein dyeing positive rate of area in lung tissues between the two groups(n=5)

2.3 大鼠肺组织 NF-κB、MMP-2及 TIMP-2mRNA表达的比较

与对照组相比，模型组 4 h和 8 h时 NF-κB、MMP-2mRNA表达均显著增高(P＜0.01)，TIMP-2mRNA表达均明显降低(P＜0.05)。(见表3)

2.4 大鼠肺组织病理学改变

光镜观察：对照组大鼠肺表面呈淡红色，结构完整，肺泡隔均匀一致，组织小叶结构清晰，纤维结缔组织无增生，肺泡腔清晰可见，肺泡壁无增厚，支气管粘膜上皮完整，肺泡腔细支气管腔未见明显炎细胞及渗出物。模型组4 h与8 h时大鼠肺泡腔内充满炎性渗出物和出血，肺泡壁毛细血管扩张充血，细支气管粘膜上损伤部分脱落，管壁上大量淋巴细胞浸润，管壁增厚，可见肺不张，肺气肿(彩插3见图1)。

3 讨论

MMP-2属于明胶酶的一种，亦称明胶酶 A，MMP-2以无活性酶原的形式由多种细胞分泌，如成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等，在激活剂的作用下转变为成熟的酶，其作用底物为 IV、V型胶原。MMP-2激活与表达后，能降解基底膜的主要成分IV胶原，使基底膜变薄甚至断裂，引起血管通透性增加、炎症细胞浸润，蛋白外渗，肺泡内液体增多、肺间质和肺泡水肿形成，甚至出现肺出血等。MMP-2是所有MMPs中分布最广的，当细胞恶变或损伤时，常有MMP-2的升高［4］。研究表明，正常肺组织中MMP-2呈弱表达，而脂多糖(LPS)和前炎症细胞因子(如 TNF-α)能促进 MMP-2 的表达［5］。本实验显示，正常对照组MMP-2 mRNA表达很低，静脉注射内毒素后，MMP-2在转录水平的表达增高，此实验结果与先前研究结果一致。

TIMPs是一组内源性特异性抑制MMPs活性的糖蛋白，其与 MMPs形成 1∶1复合体而抑制其活性［6］。TIMP-2是 MMP-2的特异性抑制蛋白，特异性抑制MMP-2的活性。在正常肺组织中，细胞外基质的合成和降解保持动态平衡，这对于保证正常肺功能非常重要［7］。MMPs和 TIMPs的平衡被破坏时，肺泡上皮基底膜被破坏之后可导致肺泡上皮细胞受损，富含蛋白和蛋白酶的水肿液充满肺泡，使表面活性物质灭亡。此外，基底膜完整性受到破坏后，各种损伤因子易于进入肺间质和肺泡腔，加重肺间质和实质损伤，进而引起肺功能障碍，导致肺泡萎陷和顽固性低氧血症［8］。

研究表明，转录因子 NF-κB在某些 MMP、TIMP基因启动子上有某些特异性结合位点，当细胞外信号激活这些转录因子后即可诱导MMP、TIMP表达。NF-κB可跨膜激活 P53，间接诱导 MMP-2的转录;激活的NF-κB又可反馈上调 IL-6，TNF-α等促炎因子进一步影响 MMPs 表达［9，10］。

本实验结果表明，模型组大鼠肺组织出现出血及坏死，提示造模成功。与对照组相比，模型组大鼠肺组织中的NF-κB、MMP-2蛋白及其 mRNA表达均显著增高(P＜0.01)、TIMP-2蛋白及其 mRNA表达均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。提示内毒素致急性肺损伤的发病机制可能与 NF-κB、MMP-2蛋白及其 mRNA表达升高、TIMP-2蛋白及其 mRNA表达降低有关。

表3 两组大鼠肺组织NF-κB、MMP-2及TIMP-2 mRNA表达的比较 (n=4)Tab.3 Comparison of expression of NF-κB ，MMP-2 and TIMP-2 mRNA in lung tissues between the two groups(n=4)

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Expression of the MMP-2 and TIMP-2 Protein and Its mRNA in Rats with Acute Lung Injury Caused by Lipopolysaccharide

RUAN Qiong1，SU Zhong-hao2，YANG Ai-dong2，LI Wen-wen2，WANG Dong-ying2，WU Zhong-hua2，PANG Hui-fang2
(1.Department of Emergency Medicine，Shanghai Eingth People's Hospital，Shanghai 200233，China;2.The Basic Medicine College of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China)

Objective To investigate the changes of NF-κB，MMP-2 and TIMP-2 protein and its mRNA in the rats with acute lung injury(ALI)caused by lipopolysaccharide(LPS).Methods Twenty male Wistar rats were randomly divided into two groups： normal control group，LPS model group.Each group had two subgroups，4 hours and 8 hours after LPS were injected.The ALI model was established by intravenous injection of LPS(10 mg/kg)through a tailvein.Then the white blood cell(WBC)in blood and the protein content in bronchial alveolar lavage fluid(BALF)were measured，the expressions of nuclear factor-κB(NF-κB) ，matrixmetalloproteinase-2(MMP-2) and tissueinhibitorofmatrix metalloproteinases(TIMP-2)protein in pulmonary tissues were measured by immunohistochemistry ABC，the expression NF-κB ，MMP-2 and TIMP-2mRNA were measured by real-time fluorescent polymerase chain reaction(PCR) ，while the histopathology of the lung injury was observed by light microscope.Results Compared with normal group，the expression of NF-κB and MMP-2 protien dyeing positive rate of area and its mRNA in LPS model group were obviously increased at 4 hours and 8 hours(P＜0.01) ，and the expression of TIMP-2 protein dyeing positive rate of area and its mRNA at 4 hours and 8 hours were obviously decreased in LPS model group(P＜0.05or P＜0.01).Light microscope observation indicatedthat there were pulmonary hemorrhage and necrosis in model group.Conclusion The increasing of expression NF-κB and MMP-2 protein and its mRNA and the decreasing of expression TIMP-2 protein and its mRNA may be the mechanism of ALI caused by LPS.

Lipopolysaccharide;Acute lung injury;NF-κB;MMP-2;TIMP-2

R563.9 R332

A

1671-7856(2011)03-0039-04

2010-08-26

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.010

上海市教委高校高水平特色发展项目(No.(2005)81);上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金(P13908)。

阮琼(1969-)，女，主治医师，主要从事急诊医学临床与实验研究。

杨爱东，副教授，硕士生导师，主要从事中医药防治急性肺损伤的分子机制研究。aidongy@126.com。