钒卤代过氧化物酶构象模型分子的设计、合成及仿生催化活性

曹运珠 魏东明 任冬雪 陈 晨 邢永恒,* 施 展

(1辽宁师范大学化学化工学院,辽宁大连116029;2吉林大学化学学院,无机合成与制备化学国家重点实验室,长春130012)

钒卤代过氧化物酶构象模型分子的设计、合成及仿生催化活性

曹运珠1魏东明1任冬雪1陈 晨1邢永恒1,*施 展2

(1辽宁师范大学化学化工学院,辽宁大连116029;2吉林大学化学学院,无机合成与制备化学国家重点实验室,长春130012)

基于钒卤代过氧化物酶(V-HPOs)活性中心的N、O配位环境及活性中心与氨基酸残基、水分子之间的氢键作用的模拟,我们设计、合成了两种钒氧配合物:(C3H5N2)2[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2](1)和(VO2)2(μ2-C2O4)(C3H4N2)2(2),并通过X射线单晶衍射方法确定了它们的结构.晶体结构分析表明上述钒氧配合物的配位环境与(V-HPOs)活性中心十分相似,且在配合物的三维堆积结构中具有类α-螺旋结构.溴化反应活性研究发现这些钒氧配合物在仿生催化实验中表现出较高的催化活性.

钒卤代过氧化物酶; 钒氧配合物; 晶体结构;α-螺旋; 分子构象

Abstract: Based on mimicing the N,O coordination environment of the active center of vanadium haloperoxidase(V-HPOs)and the hydrogen-bond interaction between the active center and amino acid residues or water molecules,we designed and synthesized two kinds of oxidovanadium complexes:(C3H5N2)2[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2](1)and(VO2)2(μ2-C2O4)(C3H4N2)2(2).We determined their structures by X-ray single crystal diffraction.The crystal structure analysis indicated that the coordination environments of those oxidovanadium complexes were similar to the active center of vanadium haloperoxidase,and there seemed to be a mimicingα-helix structure in the three-dimensional packing structure of the complexes.Additionally,by studying the bromination reaction activity we found that the oxidovanadium complexes had an upper activity during the mimic catalytic process.

Key Words:Vanadium haloperoxidase;Oxidovanadium complex;Crystal structure;α-Helix;Molecule conformation

1 引言

1984年Vilter1发现钒是褐藻(Ascophyllum nodo-sum)分泌的溴化过氧化酶中必需元素,1995-1996年Messerschmidt和Wever2,3通过X射线单晶衍射方法确定了钒溴过氧化物酶(V-BrPO)及钒氯过氧化物酶(V-ClPO)的结构.两种过氧化物酶的活性中心都呈现氨基酸序列的高度同系现象,结构与图1相似.4-6活性中心的钒(V)与邻近的组氨酸咪唑基上的N共价键合,钒周围的氧则与氨基酸中的氢形成氢键,整体呈现三角双锥构型.7以酶活性中心的结构为基础,合成简单高效的类酶化合物一直是科学家们研究的热点.8-10近二十年来合成的几类钒卤代过氧化物酶(V-HPOs)模型为:11-16(i)V(V)和V(IV)与希夫碱类配体形成的配合物;(ii)过氧化钒配合物;(iii)钒-三角胺类模型配合物,它们都只是做到模拟钒卤代过氧化物酶(V-HPOs)部分结构而已,且催化活性不理想,毒性大,所以仍需要我们对该酶模型的合成和机理进行进一步探索.

酶作为功能性分子以及千变万化的空间构象为其行使催化功能奠定了基础.17,18这让我们在设计合成酶模型化合物时,不但要模拟活性中心配位微环境,还要考虑模拟酶的空间结构.为此本文选定含氮、氧的小分子做配体,一方面模拟活性中心的金属与氮氧的配位键,另一方面可以通过较多的氧原子形成更多的氢键模拟酶的多级结构.在常温条件下，水醇体系中首次获得配合物1和2,并对上述配合物进行仿生溴化实验及催化动力学研究.

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

JASCO FT/IR-480型傅里叶变换红外光谱仪(JASCO日本分光公司,日本)(200-4000 cm-1,KBr压片);PE 240C型元素分析仪(PE公司,美国);Bruker AXS SMARTAPEX II CCD型X射线单晶衍射仪(Bruker公司,德国);紫外可见光谱用PE Lambda 35型光谱仪(PE公司,美国)和721分光光度计(上海第三分析仪器厂)测定.VOSO4·nH2O(上海绿源精细化工厂),分析纯;NH4VO3(沈阳市试剂二厂),分析纯;吡唑(百灵威化学品公司),分析纯;草酸(百灵威化学品公司),分析纯;咪唑(百灵威化学品公司),分析纯;甲醇、乙醇(天津市化学试剂三厂),分析纯;苯酚红(天津市化学试剂一厂),分析纯;溴化钾(自贡制药厂),分析纯;过氧化氢(辽宁永强医药器械化玻有限公司试剂一厂),分析纯;磷酸氢二钠(汕头市金砂化工厂),分析纯;磷酸二氢钠(沈阳市试剂三厂),分析纯.

2.2 配合物的合成

2.2.1 配合物(C3H5N2)2[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2](1)的合成

将草酸(0.09 g,1 mmol)和咪唑(0.042 g,0.6 mmol)溶于10 mL乙醇中,加入VOSO4·nH2O(0.14 g,VOSO4的纯度为71%,0.6 mmol)的5 mL水溶液,用浓盐酸调pH值到2,室温搅拌4 h,得到蓝色溶液,过滤,所得滤液在室温条件下放置,两周后有蓝绿色晶体析出.称重0.12 g,产率:69.9%(以VOSO4中的钒为基准).元素分析(C12H14N4O16V2)测定值(%):C,24.78;H,2.40;N,9.58,理论值(%):C,25.19;H,2.46;N,9.79.

2.2.2 配合物(VO2)2(μ2-C2O4)(C3H4N2)4(2)的合成

将草酸(0.045 g,0.5 mmol)和吡唑(0.14 g,2 mmol)溶于10 mL甲醇中,加入NH4VO3(0.12 g,1 mmol)的水溶液,室温4 h,得到黄绿色浊液,过滤,所得黄绿色滤液放置几天后从母液中析出黄绿色晶体.称重0.14 g,产率:53.2%(以NH4VO3中的钒为基准).元素分析(C14H16N8O8V2)测定值(%):C,31.11;H,3.12;N,21.18,理论值(%):C,31.95;H,3.06;N,21.29.

2.3 配合物的晶体结构分析

选择晶体大小为0.19 mm×0.12 mm×0.08 mm配合物1和大小为0.14 mm×0.13 mm×0.12 mm配合物2的单晶,分别在Bruker SmartAPEX II CCD仪器上,Mo Kα光源(λ=0.071073 nm),室温下收集衍射数据.对配合物1,共收集到3756个衍射点,其中独立衍射点1240个,强点920个(I>2σ(I))用于结构解析;对配合物2,共收集到5165个衍射点,其中独立衍射点1738个,强点1266个(I>2σ(I))用于结构解析.衍射强度数据经Lp因子校正.晶体结构由直接法和差值Fourier合成法解出,对所有非氢原子坐标和各向异性温度因子进行全矩阵最小二乘法修正.氢原子坐标由理论加氢程序确定.所有计算均用SHELX-97程序在Pentium(III)PC计算机上进行.配合物1和2的晶体学参数列于表1,配合物1和2的分子结构及分子间弱的相互作用在SHELX-97程序和Diamond 2.1c程序中画出.

2.4 催化活性研究

苯酚红能在过氧化氢存在下结合溴离子形成溴酚蓝,通过测定生成物的吸光度变化可以分析配合物的催化活性.主要进行以下两个实验:(i)在恒温条件下,将反应物溶于水溶液中,用磷酸缓冲液保持pH=5.8,根据苯酚红特征吸收波长443 nm及溴酚蓝特征吸收波长595 nm处吸光度的变化来跟踪反应过程，实验条件为磷酸缓冲液(pH=5.8),KBr(0.4 mol·L-1),H2O2(1mmol·L-1),苯酚红(0.01mmol·L-1);(ii)通过测定不同浓度钒配合物催化下溴酚蓝吸光度随时间的变化关系计算反应速率,再通过反应速率与配合物浓度的关系,求得反应级数,实验条件为磷酸缓冲液(pH=5.8),KBr(0.4 mol·L-1),H2O2(1 mmol·L-1),苯酚红(0.02 mmol·L-1).配合物2的溴化催化活性研究方法与配合物1相同.

表1 配合物1和2的晶体学及结构精修数据Table 1 Crystallographic data and structure refinement for complexes 1 and 2

3 结果与讨论

3.1 配合物的合成及性质

配合物1和2都是在室温下水醇体系中通过自组装方法合成的,使用的钒源为VOSO4·nH2O和NH4VO3,两种晶体均是室温下反应液自然挥发得到.配合物1和2都易溶于水、甲醇等溶剂,而在乙醚、正己烷中难溶.

3.2 配合物的红外光谱

配合物1的红外光谱:峰位在3154 cm-1处的吸收峰归属为咪唑环上的N―H伸缩振动;羧基不对称性伸缩振动峰(νas(COO-))和其对称性伸缩振动峰(νs(COO-))分别出现在1652和1418 cm-1处;V＝O的特征峰在984 cm-1处;19V―O的振动峰出现在384 cm-1处.

配合物2的红外光谱:峰位在3150 cm-1的吸收峰归属为吡唑环上的N―H伸缩振动;羧基不对称性伸缩振动峰(νas(COO-))和其对称性伸缩振动峰(νs(COO-))分别出现在1652和 1355 cm-1处;V＝O的特征峰在888,903,916,935 cm-1处;20V―N和V―O的振动峰分别出现在425和365 cm-1处.

3.3 配合物的结构描述

配合物1的分子由C3H5N2+和[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2]2-构成.[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2]2-结构如图2a所示,主要键长、键角列于表2.从图2a可以看出,中心钒原子与两个草酸上的O原子(O1,O4,O5,O6)、端氧原子(O2)及水中的氧原子(O3)配位,并通过草酸分子桥联形成双核配合物.以中心钒原子、端氧原子(O2)及桥联草酸中的一个氧原子(O6)为轴形成VO6八面体配位构型.其中,O1、O3、O4、O5四个氧原子位于赤道平面,而O2和O6分别位于配位平面两侧的0.1899(2)和-0.1935(3)nm处.配合物1中,以桥联草酸配体中的C―C键中点为对称中心形成轴向反式双八面体,即八面体的赤道平面与桥联草酸平面垂直.V原子与赤道平面的氧原子所形成的V―O1、V―O3、V―O4和V―O5键长分别为 0.2072(4)、0.2044(4)、0.1970(4)和 0.2000(4)nm,表明这四个键均为单键且这与V-BrPO中的V―O键长(0.1930 nm)相近,4而轴向V―O2的键长为0.1587(4)nm,表明此键有双键特征并与V-BrPO中的V＝O键长(0.1600 nm)相近,4V―O6的键长为0.2267(4)nm,明显大于其它钒氧键长,这是由于V―O6键处在端氧的反位,受端氧的反位作用影响所致.配位平面上的四个键角O1―V―O3、O1―V―O5、O3―V―O4、O4―V―O5分别为93.86(17)°、92.16(17)°、86.98(19)°、81.28(18)°,轴向O2―V―O6键角为168.5(2)°,可见,在钒氧配合物中,钒原子处于略微畸变的八面体配位环境中.配合物1中的氧原子与配位水及咪唑阳离子中的氢原子形成分子间氢键,从而形成三维氢键结构,详细的氢键键长、键角列于表3.配合物1结构特征中除了拥有较多类似V-BrPO中的V—O与周围氨基酸形成的氢键外,还应该注意的是,该配合物在ab平面内可形成类似酶分子的二级结构中的α-螺旋结构(图3a),而链与链之间可通过与咪唑阳离子的氢键作用相互连接(图3b),这与酶的三级结构非常相似.配合物1类生物分子的结构使其在仿生溴化方面体现出较高的活性.

表2 配合物1的主要键长和键角Table 2 Selected bond lengths and angles for complex 1

表3 配合物1的氢键参数Table 3 Parameters of hydrogen bonds of complex 1

配合物2的分子结构如图2b所示,主要键长、键角列于表4.从图2b可以看出,中心钒原子与两个吡唑环上的N原子(N1,N3)、两个端氧原子(O1,O2)及草酸根中的两个氧原子(O3,O4)配位,通过草酸分子桥联形成双核配合物,每个核都以端氧原子(O2)及桥联草酸中的一个氧原子(O4)为轴形成VN2O4八面体配位构型,这与配合物1的结构相似.其中,N1,N3,O1,O3四个原子位于赤道平面,而O4和O2分别位于配位平面两侧的0.1984(8)和-0.1857(6)nm处.V原子与赤道平面原子所形成的V―O1、V―O3、V―N1和V―N3键长分别为0.1606(5)、0.2180(5)、0.2080(6)和0.2070(6)nm,轴向配位键V―O2和V―O4键长为0.1607(5)和0.2282(5)nm,其中V―N平均键长为0.2075(6)nm,这与V-BrPO中的V―N键长(0.2110 nm)相近,21而钒氧键分为两类,一类是具有双键特征的钒端氧键(V―Ot),其长度与V-BrPO中的V＝O键长(0.1600 nm)相似,而另一类钒氧键(V―Ooxalate)平均键长为0.2231(5)nm,表明此类键为单键.配位平面上的四个键角O1―V―N1、O3―V―N1、O1―V―N3、O3―V―N3分别为 94.1(2)°、82.9(2)°、95.1(2)°和 83.8(2)°,轴向O2―V―O4键角为163.5(2)°,可见,钒原子处于畸变的八面体配位环境中.配合物2与配合物1相比只存在a轴向和c轴向的氢键链,并在ac平面由氢键构成网状结构.配合物2分子间氢键键长、键角数据列于表5.

表4 配合物2的主要键长和键角Table 4 Selected bond lengths and angles for complex 2

表5 配合物2的氢键参数＊Table 5 Parameters of hydrogen bonds of complex 2＊

3.4 钒氧配合物的催化活性

以苯酚红为有机底物,在过氧化氢存在的条件下结合溴离子形成溴酚蓝,反应过程如下:

将一定量的配合物2加入到含有溴离子的苯酚红溶液中,用磷酸缓冲溶液使pH保持5.8,待反应液在常温下反应30 min后,每隔10 min测定一次吸光度与波长的曲线.从紫外光谱可以观察到在595 nm处产物溴酚蓝的吸收峰逐渐增强,而在443 nm处反应物苯酚红的吸收峰逐渐减小,表明催化反应已经发生(图4).22配合物1代替配合物2也得到相同变化的曲线图,说明配合物1同样具有催化性质.

苯酚红(R-H)的溴化反应方程式可以表示为:Br-+H2O2+R-H+H+→RBr+2H2O,23,24当有钒配合物存在时,将提高过氧化氢的活度,从而起到催化作用.不同钒配合物受配位环境、价态及空间构象等因素影响,在活化过氧键时体现出不同催化活性.由于整个溴化反应非常复杂,导致研究不同钒配合物对催化反应的影响难度增大,但是当固定苯酚红、溴离子、过氧化氢及氢离子浓度时,苯酚红溴化反应的反应速率只受钒配合物的浓度影响,其反应速率表达式可以简化为:dCRBr/dt=kCVxb(C代表浓度,V代表钒配合物,x表示钒配合物的反应级数,k反应速率常数,b值的大小由苯酚红、溴离子、过氧化氢及氢离子浓度共同决定).25,26将该式取对数得:lg(dCRBr/dt)=lgk+xlgCV+lgb,因此,反应速率只是钒配合物浓度的函数.配制系列不同浓度的钒配合物溶液,以lg(dCRBr/dt)对配合物浓度的对数作图,所得直线的斜率,即为钒配合物的反应级数.根据比尔定律:A=εdC(ε为吸光系数,d为样品池光径长度),以吸光度A对时间t作图,其斜率应为εd(dCRBr/dt),测得595 nm处溴酚蓝的ε为14500 L·mol-1·cm-1(pH=5.8),d为1 cm,计算得出反应速率.用Origin 7.0程序,根据配合物1的吸光度(A)与时间(t)的变化关系,利用线性回归函数计算直线的斜率,得出配合物1在此浓度下的反应速率dCRBr/dt.改变配合物1的浓度,得到一系列直线(图5A).以lg(dCRBr/dt)对配合物1的浓度的对数(lgCV)作图(图6a),线性回归方程为:y=0.99585x-1.70369.配合物2按照上述方法得到不同浓度时吸光度与时间的变化曲线(图5B)及反应速率对数lg(dCRBr/dt)对浓度的对数(lgCV)的曲线(图6b),线性回归方程为:y=1.01099x-2.43502.上述两个方程斜率都接近于1,说明对于配合物1和2,此反应都为一级反应.但是两个方程的截距不同,且截距为lgk+lgb,而b为定值,所以配合物1与配合物2的截距差值Δlgk=0.73133,说明配合物1的反应速率常数是配合物2的5倍.虽然配合物1与配合物2都具有部分类酶结构,但是催化活性却存在较大差异,这说明配合物的催化能力不仅受金属的配位环境影响,还会受到配合物空间构象的影响.晶体结构分析表明配合物1具有类似钒卤代过氧化物酶(V-HPOs)空间构象的结构,这也是其具有更高催化活性的主要原因.

4 结论

钒卤代过氧化物酶(V-HPOs)是具有三维空间特征的分子实体,且酶的空间结构又是其功能的结构基础.本文以简单的羧酸配体与咪唑、吡唑相组合,模拟钒卤代过氧化物酶(V-HPOs)活性中心的配位环境,合成具有部分类酶结构的钒氧配合物.通过X射线单晶衍射数据可以看出,钒氧配合物不仅具有与酶活性中心相似的配位环境，还具有较多的氢键种类,可以进一步模拟酶的二级及三级空间构象.以苯酚红为有机底物对钒配合物进行仿生溴化研究,动力学数据分析表明在模拟酶活性中心的配位环境的基础上,合成具有类酶空间结构的配合物将具有更好的催化活性.

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Design,Synthesis and Mimic Catalytic Activity of a Vanadium Haloperoxidase Conformation Model Molecule

CAO Yun-Zhu1WEI Dong-Ming1REN Dong-Xue1CHEN Chen1XING Yong-Heng1,*SHI Zhan2
(1College of Chemistry and Chemical Engineering,Liaoning Normal University,Dalian 116029,Liaoning Province,P.R.China;2State Key Laboratory of Inorganic Synthesis and Preparative Chemistry,College of Chemistry,Jilin University,Changchun 130012,P.R.China)

O641;O643

Received:October 20,2010;Revised:January 7,2011;Published on Web:February 16,2011.

∗Corresponding author.Email:yhxing2000@yahoo.com;Tel:+86-411-82156987.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21071071),Education Foundation of Dalian City,China

(2009J21DW004),and State Key Laboratory of Inorganic Synthesis and Preparative Chemistry,College of Chemistry,Jilin University,China(2010-15).

国家自然科学基金(21071071),大连市教育基金(2009J21DW004)及吉林大学无机合成与制备化学国家重点实验室(2010-15)资助