百合粉中秋水仙碱的提取及抑菌性研究

陈莉华，张 丽，徐 果

(1.吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000；2.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

百合粉中秋水仙碱的提取及抑菌性研究

陈莉华1，张 丽2，徐 果1

(1.吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000；2.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

目的：研究百合粉中秋水仙碱的提取方法及抑菌作用。方法：用有机溶剂从百合粉中提取秋水仙碱，用高效液相色谱法测定提取物中秋水仙碱含量，通过单因素和正交试验对提取条件进行优化筛选，确定适宜的工艺参数，测定秋水仙碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白念球菌、藤黄八叠球菌的体外最小抑菌质量浓度(MIC)及抑菌率。结果：提取百合粉中秋水仙碱的最佳提取条件为温度80℃、95%乙醇料液比1:6混合、提取8h；秋水仙碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白念球菌、藤黄八叠球菌的MIC分别为0.20、0.20、0.24、0.16、0.20mg/mL。结论：百合粉中的秋水仙碱对这5种菌都有明显的抑制作用。

秋水仙碱；百合粉；高效液相色谱；最小抑菌浓度；抑菌率

百合属百合科草本植物，性甘味平，具有润肺止咳、宁心安神的功效。百合具有广泛的生理活性，其中最有价值的生理活性物质卓酚酮类生物碱——秋水仙碱能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期[1]，还可抑制癌细胞的生长[2]。临床上可用来治疗癌症如乳腺癌、皮肤癌、白血病等，还可治疗何杰金氏病，治疗家族性地中海热、肾脏淀粉样变、某些皮肤病及纤维化性疾病[3]，并对原发性痛风有特异作用[4]。

生物碱一般都具有抗菌消炎作用，如白屈菜红碱对植物病原真菌具有抗菌作用[5]；博落回生物碱对多种真菌有抗菌作用[6]；黄连中的小檗碱，可以广谱抑制病原微生物，如细菌、真菌和原虫，用于多种疾病的治疗[7]。但迄今为止，秋水仙碱对常见致病菌的抑菌活性的报道较少。

通常可用超临界流体萃取[8]、重结晶、薄层层析对植物中秋水仙碱进行分离纯化[9]，得到秋水仙碱粗品，利用高效液相色谱法[10]或其他多种方法对其含量进行测定[11]。秋水仙碱的全合成步骤长、产率低、成本高。寻找提取秋水仙碱的新的植物源和探索高效的提取方法非常重要，从药食两用的百合中提取秋水仙碱不失为一种经济适用的方法。

本实验利用湘西龙山丰富的百合资源，采用有机溶剂法提取秋水仙碱，用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白念球菌、藤黄八叠球菌为对象，通过最小抑菌浓度(MIC)和抑菌率的测定对秋水仙碱体外抑菌活性进行了研究，为百合的深加工提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

百合粉产于湖南龙山县。秋水仙碱标样(纯度99%)上海化学试剂公司；其余试剂均为分析纯。

FA(N)/JA(N)型电子天平 南京大学仪器厂；索氏提取器 郑州南北仪器设备有限公司；集热式磁力搅拌器 金坛市梅香仪器有限公司；HP1100型高效液相色谱仪(紫外检测器) 美国惠普公司；旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；ZDP-2120型电热培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 培养基与菌种

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，按规定方法配制，分装灭菌备用。

菌种：大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、产气杆菌(Clostridium perfringens)、白念球菌(Albicans bacteria)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)均由吉首大学资环学院提供。

1.3 方法

1.3.1 有机溶剂提取法

用乙醇作为有机溶剂，参考文献[12]方法并加以改进用。准确称取百合粉15g，经95%乙醇浸泡过夜，于80～85℃索氏提取约8h，浓缩制得浸膏；浸膏用去离子水于50～60℃溶解，常温减压过滤除去不溶物；水提取液用石油醚(50mL×3)萃取，去掉蜡质物得到石油醚部分A，水溶液再用乙醚(50mL×3)萃取，乙醚萃取物浓缩得乙醚部分B；而后，水溶液用1% H2SO4调节pH2.5，此酸性水溶液用氯仿(40mL×3)萃取，浓缩得酸性氯仿提取物部分C；酸性水溶液用5%氨水调节pH值约为9，过滤，滤液用氯仿(30mL×3)萃取浓缩而得碱性氯仿提取物部分D(碱性生物碱部分)。将C、D混合除去溶剂干燥后即得秋水仙碱粗提物，再利用高效液相色谱检测定粗品中秋水仙碱的含量。

1.3.2 提取物中秋水仙碱的含量测定

将所得提取物除去溶剂并干燥后即得秋水仙碱粗品，准确称取一定量该提取物用甲醇定容至50mL，用高效液相色谱法(外标法)测定其中秋水仙碱含量，其测定条件如下：色谱柱为Hyfpersil ODS柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相是体积比为50:50的甲醇和磷酸二氢钾(0.5mol/L)溶液；流速1mL/min，温度25℃，检测波长为220nm。

1.3.3 秋水仙碱的抑菌效果分析

对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、产气杆菌、白念球菌、藤黄八叠球菌6种菌进行抑菌实验。

菌液制备：试验所用菌株使用前先接种于平板上，37℃培养24h后，挑选典型菌落接种于液体培养基中，经37℃培养24h后，用无菌生理盐水将其制成含菌(CFU)1×106～1×107/mL的菌悬液，备用。

最小抑菌质量浓度(MIC)的测定：采用平板稀释法，将最优条件下制备的秋水仙碱粗品用无菌蒸馏水进行倍比稀释，制备0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36mg/mL系列质量浓度稀释液。然后用无菌吸管将稀释液分别定量加入到无菌培养皿中，与定量倒入的培养基充分混匀，静置凝固后，制成含药液平板。再按培养皿上标的计量，用移液管分别吸取定量被试菌液，涂于平板上，置于适宜温度下培养一段时间后，观察菌落生长情况，以平板菌落计数法计算菌落数，另取一系列不加任何药液的平板作为空白对照。以肉眼观测完全没有菌落生长的最低生物碱质量浓度作为该药物的最小抑菌质量浓度(MIC)。将培养皿置于37℃恒温箱内培养24h，重复3次实验。

抑菌率的计算：

式中：c1、c2分别是指空白平皿和涂有药液的平皿上的菌落数。

1.3.4 试验设计

固定百合粉准确用量为15g，以提取得到的秋水仙碱粗品质量为指标，以提取温度、提取时间、料液比、乙醇体积分数4个影响因子进行单因素试验，得到各单因素的最佳值，并选取最佳值前后共3个点作为正交试验时该因素的3个水平。

2 结果与分析

2.1 秋水仙碱提取单因素试验

2.1.1 温度对百合粉中秋水仙碱提取效果的影响

图1 温度对提取效果的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of colchicine

准确称取15g百合粉，料液比1:6(g/mL)，乙醇体积分数95%，选择在50、60、70、80℃ 4个温度条件下提取8h。结果见图1。

由图1可知，提取温度由50℃升至80℃时，提取效率明显提高，几乎呈线性关系。这是因为在提取过程中，随着温度的上升，乙醇分子的运动加剧，溶剂与原料之间的交换加快，更多溶剂分子渗透到百合粉内部，使百合中更多的生物碱被溶解出来，因而提高了提取率。后续试验提取温度选择在80℃附近。

2.1.2 提取时间对百合粉中秋水仙碱提取效果的影响

准确称取15g百合粉，控制温度80℃，料液比1:6，乙醇体积分数95%，在提取时间分别为4、6、8、10h条件下进行试验。结果见图2。

图2 提取时间对秋水仙碱提取效果的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of colchicine

由图2可知，提取时间从4h到8h范围内，随着时间增加秋水仙碱提取效率明显提高，而由8h到10h区间变化很缓慢，这是由于提取物中非目标物的增加，所得秋水仙碱量反而下降，综合考虑产品得率和实验时间及经济目的，选取最佳实验提取时间为8h。

2.1.3 料液比对提取效果的影响

称取15g百合粉，温度80℃，乙醇体积分数95%，提取时间8h，选择在料液比1:4、1:5、1:6、1:7条件下进行试验。结果见图3。

图3 料液比对秋水仙碱提取效果的影响Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction efficiency of colchicine

由图3可知，在料液比1:4到1:6范围内，溶剂用量增加则提取量增加，料液比小于1:6后提取效果反而下降，从经济角度来看，进一步增加溶剂所产生的经济效果并不显著。因此，确定后续实验的料液比以1:6为宜。

2.1.4 乙醇体积分数对提取效果的影响

称取15g百合粉，温度80℃，料液比1:6，提取时间8h，在乙醇体积分数50%、65%、80%、95% 4个条件下进行试验。结果见图4。

图4 乙醇体积分数对秋水仙碱提取效果的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of colchicine

由图4可知，乙醇体积分数增加秋水仙碱提取效率也增加，且乙醇体积分数从80%升到95%时上升已变得越来越缓慢，可以预见，乙醇体积分数再增大，提取效率也不会增大很多，出于经济考虑，选择乙醇体积分数95%作为秋水仙碱提取的最佳条件。

2.2 秋水仙碱提取正交试验

在单因素试验的基础上，选取提取温度、提取时间、乙醇用量、乙醇体积分数4个因素为变量进行正交试验，正交试验设计见表1。

表1 秋水仙碱提取正交试验因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2.2.1 正交试验结果及分析

采用F检验法分析得出RA＞RC＞RD＞RB(表2)，即在影响提取率的各因素中，影响大小分别为：提取温度＞料液比＞乙醇体积分数＞提取时间。结合本实验可知，从百合粉中提取秋水仙碱的最佳工艺条件为A3、B2、C2、D3，即当原料经80℃回流，按1:6的95%的乙醇作溶剂提取8h，即可达到在此实验条件范围内的最佳提取效果。

表2 秋水仙碱提取正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design layout, experimental results and range analysis

2.2.2 验证实验

用上述最佳条件进行验证实验，即百合粉15g在80℃、料液比1:6、乙醇体积分数95%条件下，提取8h，3次平行实验，提取出的粗品中含5.36、5.35、5.37mg秋水仙碱，平均值为5.36mg，提取率为0.0357%。

2.3 秋水仙碱抑菌效果的测定

2.3.1 秋水仙碱MIC的测定

将秋水仙碱晶体用无菌蒸馏水进行倍比稀释成0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36mg/mL 7组质量浓度系列，测定体外MIC，另设对照组进行对照实验。

表3 秋水仙碱MIC的测定结果(n=3)Table 3 Minimal inhibitory concentrations (MIC) of colchicines for different species of bacteria (n=3)CFU/mL

由表3可知，秋水仙碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的MIC为0.20mg/mL，而对枯草杆菌的MIC为0.24mg/mL，对白念球菌的MIC为0.16mg/mL。实验结果表明秋水仙碱对这5种细菌的抑菌效果都比较显著。

2.3.2 秋水仙碱的抑菌率

实验百合粉提取物秋水仙碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白念球菌、藤黄八叠球菌、产气杆菌6种供试菌的抑菌率，秋水仙碱对产气杆菌没有抑菌效果，对其余5中供试菌均有一定的抑菌效果，结果见表4。

表4 秋水仙碱的抑菌率(n=3)Table 4 Antibacterial rates of colchicines for different species of bacteria (n=3) %

由表4可知，这5种供试菌的菌落数随秋水仙碱药液质量浓度的增加而减少，表明秋水仙碱对这5种菌具有显著的抑菌效果。药液质量浓度对5种供试菌抑菌率的多重比较表明，当药液质量浓度为0.12、0.16mg/mL时，供试菌对药液的作用不敏感(菌落数为33.800～2.000)，当药液质量浓度达0.24mg/mL时，药液对供试菌产生显著的抑制作用。

3 结 论

用乙醇作为溶剂提取百合粉中秋水仙碱的方法简便易行，实用性强，提取物对引起严重腹泻和败血症的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)有强的抑菌效果，本实验结果表明有望通过百合的大规模种植提取附加值高的医药中间品，使百合的产业链向高端延伸。

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Extraction and Antibacterial Activity of Colchicine from Lily Root Powder

CHEN Li-hua1，ZHANG Li2，XU Guo1
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China；2. College of Biology and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China)

Objective: To explore the extraction and antibacterial activity of colchicine from lily root powder. Methods:Colchicine was extracted from the dry powder of lily roots. The content of colchicine in the extract was determined by using high performance liquid chromatography (HPLC). The optimal extraction conditions were explored by single factor and orthogonal array design methods. Minimal inhibitory concentration (MIC) and antibacterial rate of colchicine were measured by bacteriostasis testsin vitro. Results: The optimal extraction conditions were extraction temperature of 80 ℃, ethanol concentration of 95%, material-liquid ratio of 1:6 and extraction time of 8 h. The MICs of colchicine againstEscherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,Albicans bacteriaandSarcina luteawere 0.20, 0.20, 0.24, 0.16 mg/mL and 0.20 mg/mL, respectively.Conclusion: The colchicine in lily roots has significant inhibition effect on five species of bacteriain vitro.

colchicines；lily root powder；HPLC；minimal inhibitory concentration；antibacterial rate

R284.2

A

1002-6630(2011)06-0057-04

2010-06-12

科技部科技型中小企业技术创新基金项目(10C26214302421)

陈莉华(1961—)，女，教授，博士，研究方向为天然产物生理活性成分的提取及应用。E-mail：chenlihua99@163.com