2型糖尿病大鼠的尿液代谢组学改变

袁 琳，白永生，周明眉，胡 娜，陆 雄

(上海中医药大学科技实验中心，上海 201203)

2型糖尿病大鼠的尿液代谢组学改变

袁 琳，白永生，周明眉，胡 娜，陆 雄

(上海中医药大学科技实验中心，上海 201203)

目的 通过检测2型糖尿病大鼠尿液代谢谱的变化，探讨代谢组学在糖尿病研究中的应用。方法SD大鼠高糖高脂饲料喂养6周后，腹腔注射链脲菌素(Streptozotocin，STZ)37 mg/kg建立2型糖尿病模型，动态检测空腹血糖(FBG)变化，检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)及胰岛素(INS)水平。分别于造模前、造模后1、2、4、6、8周收集大鼠尿液，采用氯甲酸乙酯(ECF)衍生和气相色谱质谱联用(GC/MS)的方法检测大鼠尿液代谢谱的变化。结果 造模后大鼠FBG持续升高，FFA、TG、TC明显升高，血清INS含量明显降低;造模后，模型组大鼠代谢谱与对照组完全区分，并随时间变化逐渐偏离;比较两组差异，从差异变量中鉴定出10个生物学标记物。结论 高糖高脂喂养联合小剂量STZ造模2型糖尿病大鼠尿液代谢组学发生明显变化，尿液代谢组学在一定程度上反映2型糖尿病大鼠的病理变化。

2型糖尿病;大鼠;高糖高脂喂养;链脲菌素;代谢组学

本研究通过尿液为基础的代谢组学分析方法，研究高糖高脂饲料联合STZ诱导的大鼠糖尿病模型不同阶段尿液代谢谱的变化，探索代谢组学在糖尿病研究中的应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Sprague Dawley雄性大鼠17只，4周龄，体重80～90 g，来源于上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2003-0002】，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 试剂与仪器

链脲佐菌素，Sigma公司，批号：015K1279;胰岛素放射免疫分析药盒，上海放射免疫分析技术研究有限公司，批号：20071030;全自动生化分析仪测定所用甘油三酯与总胆固醇试剂盒，上海丰汇医学科技有限公司，批号分别为050338，050627;游离脂肪酸(NEFA)测试盒，南京建成生物工程研究所，批号：20080527;L-2-氯苯丙氨酸，上海瀛正科技有限公司，批号：060507;氯甲酸乙酯，批号：110713-2006009; 氯仿，批号：041007; 吡啶，批号：L0509201，均购自上海润洁化学试剂有限公司。放射免疫计数器，型号：SN-682γ，中国科学院上海原子能研究所生产;全自动生化分析仪，型号：日立7080;气相色谱质谱联用仪，Agilent 6890N气相色谱仪和5975B质谱仪，美国安捷伦(Agilent)科技公司;新型大鼠代谢笼，苏州市冯氏实验动物设备有限公司。

1.3 造模方法

SD雄性大鼠随机分为正常对照组7只与糖尿病模型组10只。对照组大鼠普通饲料喂养，模型组大鼠以高糖高脂饲料(为普通饲料基础上添加10%猪油、10%蛋黄粉和20%蔗糖)喂养。喂养6周后，模型组按37 mg/kg的剂量腹腔注射2%STZ溶液(临用前用0.l mol/L，pH 4.4的柠檬酸缓冲液)，对照组注射等剂量的柠檬酸缓冲液作为对照。一周后检测造模组大鼠FBG≥7.0 mmol/L为糖尿病成模大鼠，成模7只。

1.4 生化指标检测

分别于造模后 1、2、4、6、8 周末，大鼠禁食 12 h后尾静脉取血检测FBG。8周末腹主动脉取血，酶学方法检测 TG、TC;铜离子结合法检测 FFA，放免法检测INS，均按照试剂盒说明书操作。

1.5 尿液标本收集处理

分别于造模后 1、2、4、6、8 周末，代谢笼收集大鼠尿液，-70℃冰箱保存。

尿液代谢谱测定方法：取尿液1.5 mL，12 000 r/min离心10 min后，取上清液300 μL，依次加入蒸馏水300 μL、内标物(0.1 mg/mL氯苯丙氨酸)100 μL、无水乙醇 400 μL、吡啶 100 μL、氯甲酸乙酯(ECF)50 μL，振荡 10 s，超声 1 min;加入氯仿 300 μL，振荡30 s后，3000 r/min离心 5 min;加入 100 μL 7 mol/L的 NaOH 溶液，同时加入 ECF 50 μL，振荡10 s，超声1 min;振荡30 s后，3000 r/min离心10 min。吸去上清液，氯仿层加入少量无水硫酸钠，干燥后，进入气相色谱质谱联用仪(GC/MS)，用 DB-5MS色谱柱进行分离。①色谱条件：色谱柱 DB-5MS毛细管柱(5%diphenyl cross-linked 95%dimethylpolysiloxane ：30 m × 250 μm i.d.，0.25 μm;Agilent J＆W Scientific，Folsom，CA);不分流进样。进样量1 μL。进样口温度 280℃;离子源温度 200℃;接口温度260℃。程序升温起始温度 80℃;保持2 min，以 10℃ /min升至 140℃，以 4℃ /min 升至240℃，再以 10℃ /min升至 280℃，保持 3 min。载气为氦气，载气流速 1 mL/min。②质谱条件：溶剂延时5 min;电离方式EI;电子能量70 eV;质谱扫描范围：m/z 30-550;全扫描方式。

1.6 统计学处理

生化数据以(¯x±s)表示。使用计算机软件SSPS13.0进行统计学分析，组间均数比较用t检验，P＜0.05表示差异具有显著性。

代谢组学数据统计处理：原始 GC/MS数据文件，色谱峰经XCMS软件进行峰提取，去除内标峰和柱流失峰后，以 Excel文件贮存，导入到 SIMCA-P 11.0软件包(Umetrics，Umeå，Sweden)，采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和最小方差判别分析法(partial least square-discriminant analysis，PLS-DA)进行统计分析。

2 结果

2.1 糖尿病大鼠生化指标

造模后1周内，模型组 FBG明显升高，在之后的8周动态观察中FBG基本稳定，与对照组比较差异均有显著性(P＜0.01)(表1)。造模8周末，模型组大鼠FFA、TG、TC的明显升高，血清胰岛素含量明显降低，与对照组比较差异均有显著性(P＜0.05或P＜0.01)(表2)。

表1 FBG动态变化(s，n=7，mmol/L)Tab.1 Comparison of fasting blood glucose

表1 FBG动态变化(s，n=7，mmol/L)Tab.1 Comparison of fasting blood glucose

注：**与正常组比较 P＜0.01。Note：compared with the control group，**P＜0.01.

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表2 FFA、TG、TC、INS变化(s，n=7)Tab.2 Comparison of the changes of free fatty acid，triglyceides，total cholesterol and insulin

表2 FFA、TG、TC、INS变化(s，n=7)Tab.2 Comparison of the changes of free fatty acid，triglyceides，total cholesterol and insulin

注：*与对照组比较 P＜0.05，**P＜0.01。Note：compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

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2.2 尿液代谢谱的变化

2.2.1 模型组与对照组代谢模式的比较：氯甲酸乙酯衍生、气质联用分析得到的色谱质谱数据经过提取和前处理得到的矩阵在SIMCA-P软件中进行多维统计分析，采用非监督的PCA方法，对动物样本进行分组处理。从结果看出，造模前、模型组与对照组的代谢谱无差异;造模后1周、4周、8周后，模型组与对照组之间的代谢轮廓有清晰的区分，说明糖尿病大鼠成模后两组间的动物在代谢谱上差异有着显著性 (图1 A-D，彩插5)。

为了更加直观地将正常大鼠在喂养过程以及模型大鼠在成模后代谢模式的变化呈现，本实验将对照组和模型组大鼠尿样的代谢组数据进行多维统计的分析。结果表明，对照组动物在喂养的过程中，随着时间的推移，除了第4周的样本与其他几周的样本有些分离趋势，其他几周的样本间没有明显的分离(图2，彩插5)。糖尿病模型大鼠代谢模式则呈现规律性变化，随时间不断向左推移(图3，彩插5)。

2.2.2 样本的PLS-DA分析：非监督的多维统计方法(如上面用到的PCA)可以反应不同动物代谢物之间的总体差异，但这种差异是一种广泛性的差异，包括各种因素的影响。为了更好的反应糖尿病病理状态下产生的差异，试验中采用了偏最小方差―判别分析(PLS-DA分析)。通过这种监督的方法建立的模型，可以找到对模型影响较大的代谢物变量，而这些代谢物是与高糖高脂饲料喂养和STZ损害有着密切的关系，有利于对高糖高脂饲料喂养联合STZ诱导的糖尿病大鼠模型发生机制做深入的理解。

本实验选择了病理变化程度最大的第8周的样品进行PLS-DA的代谢模式比较。对照组大鼠与模型组大鼠尿液代谢物有着很好的区分，并且分析59个差异变量，利用NIST谱库，鉴定了其中10个代谢物 (见表3)。

表3 尿液代谢谱中主要代谢物的变化Tab.3 Changes of main variables in urine metabolic profiles of the rats

3 讨论

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。它通过对生物体液和组织中随时间改变的代谢物进行检测、确定、定量和分类，将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，以监测活细胞中的化学变化。目前代谢组学已应用于包括疾病的诊断、药物作用机制研究、药物研发、分子生理学、分子病理学、基因功能组学、营养学、环境科学等重要领域［2］。

糖尿病是一种以糖代谢失常为主的内分泌代谢性疾病，通常表现为整体的代谢紊乱，因此代谢组学的方法非常适合于糖尿病的研究。高糖高脂饲料喂养联合低剂量STZ注射制备的糖尿病大鼠模型是常用的2型糖尿病模型，由于它与人类2型糖尿病有着相似的发病机制，并且成模率高，模型稳定，为研究2型糖尿病提供了良好的基础［3］。在糖尿病状态下，由于血糖升高引起尿糖，带走大量水分而出现多尿，尿液内小分子代谢物的含量却相对较少。这就给采用尿液做样本，通过代谢组学方法研究糖尿病造成一定的困难。GC/MS是目前较常用的代谢组学研究方法，与其他代谢组学方法，如核磁共振技术(NMR)、液相色谱/质谱(LC/MS)方法比较，它的优势在于具有较高的分辨率和检测灵敏度，并且有可供参考的标准谱图库，可以方便地得到待分析代谢组分的定性结果，其局限性表现为GC只能对样品中的挥发性组分实现直接分析，而得不到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息［4］，如果能将这类物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物，就可以扩大气相色谱的测定范围。因此，挥发性化学衍生物的形成在气相色谱中具有重要的应用价值。ECF作为胺的酰基化试剂，衍生产物色谱性能优良。本研究采用ECF的衍生和GC/MS为基础的代谢组学方法研究高糖高脂饲料联合STZ诱导的大鼠糖尿病模型尿液代谢谱的变化，取得了良好的分离效果。

从实验结果来看，造模前模型组与对照组的代谢谱无差异;造模1周后，模型组与对照组之间的代谢轮廓有清晰的区分，说明大鼠正常生理代谢被明显干扰。在随后的几周中，虽然模型组FBG水平基本保持稳定，但是其代谢图谱随着时间的变化不断偏离，表明尿液的代谢谱中包含更多糖尿病病理变化信息。为了确定高糖高脂饲料喂养联合STZ诱导的糖尿病大鼠相关的代谢物，选取实验末样品进行PLS-DA的代谢模式比较，找出了差异变量，并利用NIST谱库，鉴定了10个代谢物，其中一些三羧酸循环的代谢产物如琥珀酸、柠檬酸盐等都有降低，同时一些氨基酸物质包括亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和一些有机酸(如丙酸、醋酸)的表达水平在模型组中都有上升。这与糖尿病病理状况相符，胰岛素不足时，一些酶活性减弱，使三羧酸循环减弱;同时蛋白质代谢紊乱，肌肉及肝中蛋白质合成减少而分解增多，血浆及尿液中氨基酸增多。另外，本实验还检测到一些含有苯环的化合物，例如对羟基苯乙酸、马尿酸水平降低。这些含苯基的化合物主要是由肠道内的菌群代谢产生，代谢的母体主要是食物中的多酚和食物蛋白分解出来的一些芳香族的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸等［5，6］，表明糖尿病大鼠的肠道内的菌群代谢发生紊乱。对这些内源性化合物代谢通路的进一步分析，对于深入研究糖尿病病因及发病机制有着极其重要的意义。

(本文图1～3见彩插5。)

［1］ Lindon JC，Holmes E，Nicholson JK.So what’s the deal with the metabonomics? ［J］.Anal Chem，2003，75(17)：384A-391A.

［2］ Lindon J C，Holmes E，Nicholoson J K，et a1.Metabonomics technologies and their applications in physiological monitoring，drug safety assessment and disease diagnosis［J］.Biomarkers，2004，9：1-31.

［3］ 何清华，周迎生，王征，等.2型糖尿病大鼠模型制备的影响因素及其特点［J］.中国实验动物学报，2007，12，15(6)：425-429.

［4］ 任洪灿，王广基，阿基业，等.代谢组学分析技术平台和数据处理的新进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2007，12(12)：1332-1338.

［5］ Nowak A，Libudzisz Z.Influence of phenol，p-cresol and indole on growth and survival of intestinal lactic acid bacteria［J］.Anaerobe，2006，12(2)：80-84.

［6］ Andreas R，Martin A，Kuhnle G，et al.Colonic metabolism of dietary polyphenols：influence of structure on microbial fermentation products［J］.Free Radic Biol Med，2004，36(2)：212-225.

Urinary metabonomic variation in type 2 diabetic rats

YUAN Lin，BAI Yong-sheng，ZHOU Ming-mei，HU Na，LU Xiong
(Experiment Center of Science and Technology，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China)

Objective To investigate the urinary metabonomic variation in diabetic rats in order to explore the application of metabonomics in research of diabetes.Methods Male Sprague-Dawley rats were fed with high-fat and high-sucrose diet for 6 weeks and then injected with vehicle or streptozotocin(STZ)in a dose of 37 mg/kg.Fasting blood glucose(FBG)was monitored weekly after STZ injection.Urines of normal rats and model rats were collected at 1，2，4，6，8 weeks after STZ injection.Serum insulin(INS)，triglyceride(TG)，total cholesterol(TC)and free fatty acids(FFA)were measured at 8 weeks after STZ injection and the rats were sacrificed.The metabolic profiles were analyzed using ethyl chloroformate(ECF)derivatization and gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS).Results Compared with the control rats，the FBG，TG，FFA were significantly higher while the INS was reduced in the model rats.The metabolism profiles of the model rats were significantly different from that of the control rats，and changed with time.Comparative study was applied and ten biological markers were different between the normal and model rats.Conclusions Significant changes in urine metabonomics occurre in type 2 diabetic rats induced by high-fat and high-sucrose diet and low dose of STZ，and it may reflect to a certain extent the pathological changes of type 2 diabetic rats.

Type 2 diabetes;Rat;high-fat，High-sucrose diet;Streptozotocin;Metabonomics

Q95-33，R-33

A

1005-4847(2011)02-0111-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.006

糖尿病是以长期高血糖为主要特征，同时伴有脂肪、蛋白质、水、电解质等代谢障碍的内分泌代谢性疾病。作为一种“综合征”，糖尿病很难用单一的评价指标和发病机制来反应其发生及变化。代谢组学(metabonomics)是研究机体代谢产物谱变化的一种新的系统方法，它借助高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，分析生物样本如尿液中内源性代谢物整体组成，通过其复杂的、动态的变化来辨识和解析被研究对象的生理病理状态，反映机体在内外因素的影响下整体代谢的变化规律［1］，因此，代谢组学对于阐明生命复杂系统具有极为重要的意义。

上海市重点学科建设项目(编号：T0301);上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金(编号：szy08043)。

袁琳(1980-)，女，研究方向：中医药防治糖尿病研究。E-mail：yl-shutcm@163.com

陆雄。E-mail：xionglu93@hotmail.com

2010-10-12