Ⅱ型胶原酶加压灌流提高成年大鼠心肌细胞分离效率

李 德，唐 兵，杨大春，马双陶，杨永健

(成都军区总医院心内科，成都 610083)

Ⅱ型胶原酶加压灌流提高成年大鼠心肌细胞分离效率

李 德，唐 兵，杨大春，马双陶，杨永健

(成都军区总医院心内科，成都 610083)

目的 探讨效率更高的成熟心肌细胞分离方法。方法 采用Ⅱ型胶原酶升主动脉逆行灌流法分离成年大鼠心肌细胞。对照组采用Langendorff装置灌流;实验组在Langendorff装置基础上加压匀速灌流。在倒置显微镜下观察细胞形态，并计算杆状细胞比率及产量;通过台盼蓝染色和局部场剌激评价心肌细胞活性。结果 分离即刻，实验组杆状细胞比率显著高于对照组【(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P＜0.01】;实验组活细胞产量也显著高于对照组［(3.6±0.7) ×107νs.(1.9±0.6) ×107，P＜0.01］。复钙过程中，实验组发生自发性收缩的细胞比率及变圆细胞比率均明显低于对照组【(10.4±2.1)% νs.(18.9±4.5)%，P＜0.01;(5.3±1.3)% νs.(8.6±1.7)%，P＜0.05】。实验组台盼蓝染色阴性的杆状细胞比率和局部场剌激条件下收缩细胞比率明显高于对照组【(95.3±8.2)% νs.(90.6±9.8)%，P＜0.05;(92.2±7.6)% νs.(85±6.4)%，P＜0.01】。结论 Ⅱ型胶原酶加压灌流可获得高产量、高活性的心肌细胞，提高了成熟心肌细胞的分离效率。

大鼠;心肌细胞;细胞分离

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，8～10周龄，体质量200～250 g，来源于第三军医大学实验动物中心【SCXK(渝)2007-0003】，所有实验严格按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。实验分组：对照组和实验组，每组各10只大鼠。

1.2 试剂

II型胶原酶购自 Sigma公司(美国);HEPES、牛血清白蛋白(BSA)购自Gibco公司(美国);其他试剂为国产分析纯。

1.3 主要液体配制

1.3.1 无钙台氏液配方 (mmol/L)：NaC1 36、KCl 5.4、NaH2PO40.33、MgC12·6 H2O 1.0、葡萄糖 10、HEPES 10，以 NaOH调整 pH=7.4。

1.3.2 0.05% Ⅱ型胶原酶：15 mgⅡ型胶原酶、30 mg BSA，溶于300 mL无钙台氏液。

1.3.3 KB 液配方(mmol/L)：KOH 20、谷氨酸钾 50、KCl 40、牛黄酸20、KH2PO420、MgC12·6 H2O 3、HEPES 10、葡萄糖 10、EGTA 0.5，以 KOH 调整 pH=7.4。

1.3.4 复钙用无钙台氏液：每100 mL无钙台氏液中加入牛黄酸0.25 g、BSA 50 mg;180 mmol CaCl2贮存液：1.998 g无水CaCl2溶于100 mL三蒸水。

1.3.5 1.8 mmol CaCl2台氏液：复钙用无钙台氏液9.9 mL加入 180 mmol CaCl2贮存液 100 μL。

1.3.6 0.18 mmol CaCl2台氏液：复钙用无钙台氏液9 mL加入1.8 mmol CaCl2钙台氏液1 mL。所有液体均用0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.4 心肌细胞的分离

整个操作过程在超净台中进行。Langendorff装置各部件高温、高压灭菌，连接管用环氧乙烷消毒。适当设置Langendorff温度，使终端灌流液的温度保持在37℃。两灌流瓶中分别预充无钙台氏液和0.05%II型胶原酶。灌流前灌流液预充混合气体(95%O2和5%CO2)15 min，并且整个灌流过程中持续充气。SD大鼠腹腔注射戊巴妥钠(35 mg/kg)和肝素液1 mL(1000 U/mL)。麻醉显效后，仰卧位固定于蛙板，75%酒精消毒胸腹部皮肤。“U”形剪开皮肤及胸壁暴露纵隔，于降主动脉段快速离断主动脉，取出心脏，置于4℃无钙台氏液，轻轻挤出心腔内血液，将心脏悬挂于灌流装置，经升主动脉逆行灌注无钙台氏液和胶原酶消化液。对照组采用Langendorff装置灌流(图1)。先以无钙台氏液灌流5 min，冲洗冠脉中的残留血液，并且解离心肌细胞之间Ca2+依赖的紧密连接，然后用0.05%II型胶原酶循环灌流20 min或直到心脏明显变软、略带微黄(图2)。实验组在改良Langendorff装置基础上用注射器辅助加压匀速灌流(图3)，流量25 mL/min，其余操作同对照组。剪下心室组织置于KB液中，撕去心外膜，用眼科镊将心肌撕成小块。转入50 mL离心管中，用吸管轻轻吹打数次。200目滤网过滤后室温静置10 min，去上清。图1～3见封三。

1.5 心肌细胞梯度复钙

加入0.18 mmol CaCl2台氏液10 mL重悬细胞，静置10 min，细胞自然沉降;吸除上清5 mL，再加入1.8 mmol CaCl2台氏液 5 mL重悬细胞，静置 10 min，细胞自然沉降，去上清;加入1.8 mmol CaCl2台氏液10 mL重悬细胞，静置10 min，细胞自然沉降。

1.6 心肌细胞产量及活性检测

1.6.1 计数：在倒置显微镜下用细胞计数板进行细胞计数，计算每个心脏细胞产量。细胞数/毫升原液=(4个大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数。

1.6.2 台盼蓝染色：用0.4%台盼蓝染色，台盼蓝拒染的细胞为活的心肌细胞，计算台盼蓝染色阴性的杆状(包括矩形)细胞占总杆状细胞数的百分比。

1.6.3 场剌激观察收缩细胞比率：将心肌细胞加入检测皿，给予局部场刺激(频率1 Hz，电压15 V，脉宽2 ms)，在倒置显微镜下计算收缩细胞比率。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 心肌细胞的形态及产量

在倒置显微镜下观察，分离即刻的心肌细胞主要有4种形态：呈杆状、矩形、圆形和团块状。高倍镜下，杆状和矩形细胞横纹清晰、棱角分明，为存活的心肌细胞;圆形和团块状细胞胞膜皱缩，无横纹，为死细胞或受损细胞(图4，封三)。实验组杆状(包括矩形)细胞比率显著高于对照组(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P＜0.01;实验组活细胞产量也显著高于对照组(3.6±0.7) × 107νs.(1.9±0.6) × 107，P＜0.01。培养48 h后心肌细胞发生形态变化，由杆状变成扁平状，棱角逐渐变得圆钝(图5，封三)。

2.2 心肌细胞活性(表1)

在复钙的过程中部分杆状和矩形细胞出现自发性收缩，少部分变圆，实验组发生自发性收缩的细胞比率及变圆细胞比率均明显低于对照组;被台酚蓝染色的细胞为死亡细胞，台盼蓝拒染的细胞为活的心肌细胞，实验组台盼蓝染色阴性的杆状(包括矩形)细胞比率明显高于对照组;局部场刺激可检测心肌细胞的收缩活性，实验组收缩细胞比率显著高 于对照组。

表1 两组心肌细胞活性比较(n=10)Tab.1 Comparison of the viability of cardiomyocytes in the two groups

3 讨论

建立稳定的心肌细胞分离方法、获得高质量的心肌细胞是成熟心室肌细胞培养成功的关键。目前成年心肌细胞的分离主要有2种方法，即离体心脏灌注消化法和心肌组织浸泡消化法［4］。离体心脏生物酶灌注消化法分离心肌细胞效果较好，分离出的成熟心肌细胞具有活性高、数量多等优点，但对实验条件和实验技术要求较高。

由于心肌细胞分离过程复杂、环节较多，传统的Langendorff装置不方便消毒灭菌，容易造成分离细胞的污染。我们将 Langendorff装置设计制作成几个可拆卸部分，以方便高温、高压消毒，使用前在超净台中进行组装。心肌细胞分离的所有操作均可在超净台中完成，大大降低了微生物污染的可能性。但是，超净台内高度有限，导致灌注压不足，影响了心肌细胞分离效果。而且，随着灌流瓶中液面的下降，灌注压进一步降低，整个消化过程中消化液流量极不稳定。消化的不同阶段对灌流速度也有明显影响。开始数分钟流速较快;消化中期消化液会变得很黏稠，流速变慢;末期因血管被消化，流速加快。实验过程中我们观察到，上述因素引起的灌流不畅明显影响心肌细胞分离效果。本研究采用II型胶原酶加压匀速灌流，每只大鼠心脏的细胞产量可达3.6×107，杆状和矩形细胞比率达90%以上，显著高于对照组，明显提高了成熟心肌细胞的分离效果。

成年大鼠心肌细胞个体大而脆弱，消化过程中的很多因素很容易引起心肌细胞的损伤，最终影响细胞的活性［5，6，7］。复钙时出现自发性收缩及变圆的细胞为“钙反常”细胞，提示在分离过程中细胞膜受到损伤。活性细胞的细胞膜完整，所以台盼蓝不能进入细胞内而拒染。死亡或损伤严重的心肌细胞膜缺乏完整性，被台盼蓝染成蓝色。本研究实验组自发收缩细胞比率和变圆细胞比率均明显低于对照组，而台盼蓝染色阴性细胞比率显著高于对照组，表明Ⅱ型胶原酶加压匀速灌流可有效减少心肌细胞损伤。收缩活性是成熟心肌细胞功能的特征性标志。场剌激研究发现，Ⅱ型胶原酶加压匀速灌流所获得的心肌细胞中收缩细胞比率显著高于对照组，表明实验组心肌细胞的功能活性也得到了较好的保护。

在心肌细胞培养过程中，除了要警惕成纤维细胞的污染外，还必须关注心肌微血管内皮细胞及平滑肌细胞的存在。内皮细胞在镜下可成“铺路石”样改变，与心肌细胞大相径庭，而血管平滑肌细胞在镜下成梭状，但一般不会发生心肌细胞特异性的“搏动”现象，可据此鉴别两者。心肌微血管内皮细胞及平滑肌细胞往往需要过度消化才会出现在培养细胞中，故如发现有以上两者的污染，则应缩短消化时间。另外，心肌细胞较大，沉降较快，分离的心肌细胞置于KB液中进行反复沉降，可有效去除细胞碎片和杂细胞，得到比较纯净的心肌细胞。

本研究采用改良Langendorff装置进行Ⅱ型胶原酶加压匀速灌流，分离成熟心肌细胞，不但满足了细胞培养的无菌要求，而且提高了成熟心肌细胞的分离效率，获得了高产量、高活性的心肌细胞，为成熟心肌细胞培养及研究奠定了基础。

(本文图1～5见封三。)

［1］ 王亭忠，席雨涛，吴格如，等.大鼠成体心肌细胞的分离和培养［J］. 第四军医大学学报，2005，26(17)：1154-1156.

［2］ 廖华，糜涛，涂志业，等.成年大鼠心肌细胞分离方法的改良［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13(33)：6536-6539.

［3］ Loughrey CM，Seidler T，Miller SL，et al.Over-expression of FK506-binding protein FKBP12.6 alters excitation-contraction coupling in adult rabbit cardiomyocytes［J］.Physiol，2004，556(3)：919-934.

［4］ 宋智钢，刘维永.成熟心肌细胞培养技术及其应用进展［J］.临床心血管病杂志，2001，17(8)：383-384.

［5］ Egorova MV，Afanaspev SA，Popov SV.A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart［J］.Bull Exp Biol Med，2005，140(3)：370-373.

［6］ 李洪，肖颖彬.成年大鼠心室肌细胞的分离、培养与鉴定［J］. 第三军医大学学报，2004，26(7)：644-646.

［7］ 王丽娟，贾大林，齐国先.成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定［J］.中国实验动物学报，2007，15(3)：175-178.

Pressure perfusion with collagenase typeⅡimproves the efficacy of isolation of adult rat cardiomyocytes

LI De，TANG Bing，YANG Da-chun，MA Shuang-tao，YANG Yong-jian
(Department of Cardiology，Chengdu Military Area Command General Hospital，Chengdu 610083，China)

Objective To explore a more effective method of isolation of adult rat cardiomyocytes.Methods Cardiomyocytes from SD rats were isolated by collagenase type II perfusion in the control group，and by pressure perfusion with collagenase type II in the experimental group.The morphology of cardiomyocytes was observed by optical microscopy and the cardiomyocyte viability was evaluated by trypan blue exclusion test and local field stimulation.Results The ratio of rod-shaped cells and yield of viable cells per rat were significantly higher in the experimental group than that in the control group［(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P ＜0.01;(3.6±0.7) × 107νs.(1.9±0.6) × 107，P ＜0.01］.During recalcification，the incidence of spontaneous contraction and deformation was significantly lower in the experimental group than that in the control group(10.4±2.1% νs.(18.9±4.5)%，P＜0.01;(5.3±1.3)% νs.(8.6±1.7)%，P＜0.05).The ratio of trypan blue test-negative cells and cells with contractile under local field stimulation were also significantly higher in the experimental group than that in the control group((95.3±8.2)% νs.(90.6±9.8)%，P＜0.05;(92.2±7.6)% νs.(85±6.4)%，P＜0.01).Conclusion Adult rat cardiomyocytes can be isolated more efficiently by collagenase typeⅡpressure perfusion.

Rat;Cardiomyocytes;cell separation

Q95-33，R542.2

A

1005-4847(2011)02-0150-03

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.014

心肌细胞已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理、发病其机制及心肌疾病治疗的重要工具。分离和培养胚胎期或新生期动物心肌细胞(未成熟心肌细胞)的实验方法较为成熟，而成年动物心肌细胞(成熟心肌细胞)的分离和培养较为困难。未成熟心肌细胞无论在功能还是在结构等方面与成熟的心肌细胞相比均存在差异，因此，来自于未成熟心肌细胞实验的结论难于推论于成熟心肌细胞，应用成熟心肌细胞进行心脏疾病发病机制和治疗研究成为心血管病领域的重要课题［1］。但由于成熟心肌细胞分离和培养较困难，技术条件要求较高，限制了成熟心肌细胞在心脏疾病研究方面的应用。目前，大多数研究均采用 Langendorff装置生物酶灌流消化法分离成熟心肌细胞［2，3］。在实验过程中，我们发现传统Langendorff装置不易消毒灭菌，分离效果不稳定，活细胞产量不高。我们对Langendorff装置进行了改良，并通过加压灌流控制流量，经长期摸索，建立了较为稳定的成年大鼠心肌细胞分离方法。

李德(1966-)，男，副主任医师，博士，研究方向：心力衰竭与心律失常。

2010-09-27