气管内反复滴入脂多糖法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型

刘君波，黄梦珊，余晨曦，王 砚，唐法娣

(浙江大学医学院呼吸药物研究实验室，浙江 杭州 310058)

气管内反复滴入脂多糖法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型

刘君波，黄梦珊，余晨曦，王 砚，唐法娣

(浙江大学医学院呼吸药物研究实验室，浙江 杭州 310058)

目的 评价脂多糖(LPS)诱发大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型的可行性。方法 气管内滴入脂多糖或生理盐水，每周1次，共8周。测定大鼠的气道阻力(RL)和肺动态顺应性(Cdyn)，计数大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及分类，肺组织病理切片行HE和AB-PAS染色，并测定肺组织粘蛋白(MUC5AC)的含量。结果 模型组大鼠RL明显升高(87.5%)，Cdyn显著下降(16.4%);BALF中白细胞总数及分类中的中性粒细胞、淋巴细胞和单核巨噬细胞数均明显高于对照组;光镜下可见病变呈慢性支气管炎及肺气肿样改变。结论 反复气管内滴入LPS可用于制备大鼠COPD模型，其肺功能、BALF细胞学及病理学改变符合人类COPD表现，可以用于实验研究。

慢性阻塞性肺疾病;脂多糖;大鼠;模型

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SD大鼠40只，雌雄各半，体重(200±20)g，购于浙江大学实验动物中心【SCXK(浙)2007-0098】。

1.1.2 药物及试剂：LPS(Esherichia coli O111：B4，美国Sigma公司);乙酰甲胆碱(Mch，美国 Sigma公司);粘蛋白(MUC5AC)的ELISA试剂盒(武汉优尔生科技有限公司)。

1.1.3 仪器：Olympus BX51/BX52系统显微镜(日本Olympus公司);MedLab生物信号记录分析系统(南京美易公司);百瑞压缩雾化器(Pari Boy N 085，德国百瑞有限公司);Eppendorf冷冻离心机(Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备：SD大鼠40只，随机分为正常对照组和慢性阻塞性肺疾病模型组。模型组大鼠乙醚麻醉后用耳镜插入喉口，以静脉套管针向气管内注入200 μg脂多糖(用生理盐水配制成1 g/L溶液)，正常对照组气管内滴入等量生理盐水(NS)，每周1次，持续8周。肺功能测定及肺组织病理学检查分别取两组中的不同大鼠。

1.2.2 大鼠气道阻力(RL)和肺动态顺应性(Cdyn)测定：大鼠于第8周后用30%乌拉坦(3.3 mL/kg，i.p.)麻醉，行气管插管，然后在大鼠前胸4-5肋间插入胸导管，将其仰卧位、置于密闭整体体积描记箱内。稳定5 min后，由MedLab生物信号记录分析系统，导出基础潮气量(VT)、气道流速(˙V)和跨肺压(Ptp)，经数据处理得出基础 RL和 Cdyn。分别配制浓度为 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 、16.0、32.0 mg/mL的Mch生理盐水溶液，置于压缩雾化器中，雾化吸入30 s，两种吸入浓度间隔5 min。测出吸入不同浓度Mch诱导的大鼠VT、˙V及Ptp，由此得出RL及Cdyn的变化，并计算气道阻力的增加值(RL%)及肺顺应性的下降值(Cdyn%)。计算公式：(RL)(cmH2O/(mL·s))=Ptp/˙V，Cdyn(mL/cm H2O)=VT/Ptp。

1.2.3 支气管肺泡灌洗液白细胞计数和分类：做完肺功能后，股动脉放血处死大鼠，用10 mL生理盐水进行支气管肺泡灌洗，灌洗分2次进行，回收支气管肺泡灌洗液(BALF)，回收率约60% ～80%。BALF 4℃，1000 r/min离心10 min，取上清液 -80℃保存，沉淀用NS 0.5 mL混匀，取细胞混悬液100 μL用白细胞计数液100 μL稀释，计数 BALF中白细胞总数，稀释液涂片，自然干燥，用瑞氏-吉姆萨染色后作白细胞分类计数。

1.2.4 肺组织病理学检查：大鼠股动脉放血处死后，取左肺组织经4%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，行 HE染色和阿尔辛蓝-过碘酸雪夫染色(AB-PAS)，并测定以下指标：

(1)肺组织炎症程度：HE染色切片中，根据炎症和上皮脱落程度将炎症分为“-、+、++、+++”四个等级。“-”即未见明显炎症细胞浸润;“+”即主支气管周围有不等量的炎症细胞浸润(炎症细胞以淋巴细胞、中性粒细胞为主，也有少量的单核细胞及嗜酸性粒细胞)，各级细支气管周围有少量或无炎症细胞浸润，支气管腔内无脓细胞，支气管结构完整;“+++”即主支气管及各级细支气管周围均有大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，也有不等量的单核细胞及嗜酸性粒细胞浸润，部分细支气管腔内充满脓细胞，并可出现管壁破坏及(或)上皮脱落;“++”介于“+”和“+++”之间。

(2)肺气肿程度：肺泡壁变薄，肺泡扩张，部分融合成小囊状，根据肺气肿的范围分为“-、+、++、+++”四个等级。“-”即无肺气肿病变;“+”即肺组织胸膜脏层下可见少量肺泡气肿;“+++”即肺气肿病变占整个切面的2/3以上;“++”介于“+”和“+++”之间。

(3)肺平均内衬间隔(Lm)：计数通过显微镜视野中央“十”字交叉线的肺间隔数(NS)。测出十字线的总长度(L)，以L/NS即得Lm，其数值反映肺泡平均直径。测量时避开支气管及血管。每张切片测8个视野，求平均值。

(4)平均肺泡数(MAN)：计数每个视野内的肺泡数，除此视野的面积，即得 MAN，其数值反应肺泡密度。测量时避开支气管及血管。每张切片测8个视野，求平均值。

(5)杯状细胞比值：AB-PAS染色切片中，杯状细胞以AB染色为主，少数杯状细胞呈PAS着色或是AB/PAS混合着色，因此观察以AB着色为杯状细胞计数指标，每张切片计数1支支气管和3～5支细支气管阳性杯状细胞数和柱状上皮细胞总数，计算阳性杯状细胞数/柱状上皮细胞总数比值，即杯状细胞阳性百分率，求平均值。

1.2.5 肺组织粘蛋白(MUC5AC)含量测定：用酶联免疫吸附法(ELISA)测定。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0 for Windows进行统计学分析，计量资料以s表示，采用两组间均数t检验，等级资料采用RADIT分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺功能的测定

两组大鼠基线及不同浓度Mch气雾吸入后的RL及Cdyn的实测值见图 1、图2，经计算 RL增加百分率及Cdyn下降百分率见图3，大鼠的基础RL值较对照组增加了 87.5%，并且基础 Cdyn值下降了16.40%，均有统计学差异(P＜0.05)，说明在模型组气流受限使RL值增加和 Cdyn值下降;在 Mch≤1 mg/mL刺激下，模型组 RL均明显高于对照组(P＜0.05);Mch 浓度为 2、4、16、32 mg/mL 时，对照组 RL增加百分率和Cdyn下降百分率均显著高于模型组，说明模型组对Mch气雾刺激呈低反应。

2.2 BALF中白细胞总数和分类计数

模型组BALF中白细胞总数、中性粒细胞数、淋巴细胞数和单核巨噬细胞数均较对照组明显增多(表1)。

2.3 肺组织病理学改变

2.3.1 肺组织炎症： 光镜下可见对照组支气管周围及间质无炎症细胞浸润(图4A，彩插7)。模型组大鼠可见不同程度的慢性支气管炎及肺间质炎，炎症细胞明显浸润，炎症以支气管周围及血管周围为主，炎症细胞以淋巴细胞为主，也有较多的单核细胞及浆细胞存在，气管腔内以中性粒细胞为主(表2图4B见彩插7)。

图1 基线及各Mch浓度刺激下的RL值Fig.1 The lung resistance(RL)in rats after methacholine inhalation.

图2 基线及各Mch浓度刺激下的Cdyn值Fig.2 The lung dynamic compliance(Cdyn)in rats after methacholine inhalation.

图3 不同Mch浓度刺激下的大鼠气道反应Fig.3 The airway responsiveness induced by methacholine inhalation.

2.3.2 肺气肿样改变：光镜下可见正常组肺泡未见扩张，结构正常(图5A见彩插7);模型组肺泡大小不等，肺泡结构紊乱，肺泡管、肺泡囊和肺泡明显扩张，肺泡壁变薄，并有不同程度的撕裂，融合成肺大泡，与正常组比较，Lm明显增大，MAN明显减少(图 5B见彩插 7，表 3，表4)。

2.3.3 支气管杯状细胞增生及肺组织粘蛋白含量：模型组与正常组比较，支气管、细支气管杯状细胞明显增生(图6A、6B，彩插7)，杯状细胞阳性百分率显著增高;肺组织 MUC5AC的含量也明显增高(表5)。

表1 对照组与模型组大鼠BALF中白细胞总数及分类计数的比较 ( s，n=10)Tab.1 Total and differential white blood cell counts in BALF of the rats.(s，n=10)

表1 对照组与模型组大鼠BALF中白细胞总数及分类计数的比较 ( s，n=10)Tab.1 Total and differential white blood cell counts in BALF of the rats.(s，n=10)

注：与对照组比较，**P ＜0.01，***P ＜0.001Note： vs.control group，**P ＜0.01，***P ＜0.001

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表2 对照组与模型组大鼠肺组织炎症 (n=10)Tab.2 Inflammation of the rat lung tissues(n=10)

表3 对照组与模型组大鼠肺气肿改变(n=10)Tab.3 Emphysematous changes in the rats(n=10)

表4 对照组与模型组大鼠肺泡结构改变(s，n=10)Tab.4 Alveolar changes in the rats(s，n=10)

表4 对照组与模型组大鼠肺泡结构改变(s，n=10)Tab.4 Alveolar changes in the rats(s，n=10)

注：与对照组比较，***P＜0.001Note： vs.control group，***P ＜0.001

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表5 大鼠支气管阳性杯状细胞增生及粘蛋白含量(± s，n=10)Tab.5 Airway goblet cell proliferation and MUC5AC content in the rats(s，n=10)

表5 大鼠支气管阳性杯状细胞增生及粘蛋白含量(± s，n=10)Tab.5 Airway goblet cell proliferation and MUC5AC content in the rats(s，n=10)

注：与对照组比较，*P ＜0.05，***P ＜0.001Note： vs.control group，*P ＜0.05，***P ＜0.001

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3 讨论

COPD是具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，气流阻塞呈进行性发展，但部分有可逆性，可伴有气道高反应性。符合临床实际的理想的COPD动物模型应具有与人类疾病相一致的以气流受限为特征的肺功能改变，同时还伴有肺内中性粒细胞占优势的炎症反应和气道、肺实质及肺血管的损伤。应具备如下标准：①致伤因素与临床COPD常见诱因基本一致;②必须有气流阻塞存在，小气道阻力增高、肺动态顺应性下降;③气道重塑(建);④可伴有气道高反应性。

脂多糖存在于革兰阴性菌的细胞外壁，主要由类脂质和多糖构成，在环境中普遍存在。研究表明，COPD并非全部由吸烟引起的，其他一些环境暴露或职业性暴露也是COPD的重要致病因素，而这些环境或职业性暴露如有机粉尘等的活性成分就是内毒素。研究表明，LPS能促进很多导致肺气肿改变的病理学机制，如氧化应激，蛋白酶与抗蛋白酶失衡及凋亡等。文献报道人长期暴露于含有LPS的有机粉尘可以导致类似于COPD的临床表现，动物实验也表明LPS的慢性暴露可以导致与COPD和肺气肿相同的病理生理学改变［8］，形成伴有慢性炎症反应的不可逆的肺泡扩大［5，6］。

动物肺功能的测定对确定模型是否出现气流受限具有重要的意义。本实验中我们通过测定大鼠基线及不同Mch浓度刺激下的RL及Cdyn值后发现，大鼠的基础RL值较对照组增高87.5%，基础Cdyn值下降16.4%，均有统计学差异，说明存在气流阻塞。但是，通过计算不同 Mch浓度刺激下的 RL增加百分率和 Cdyn降低百分率我们可以发现，模型组对Mch气雾刺激的反应不如对照组明显。已有文献报道［12-14］，对于存在气道黏液高分泌的大动物(狗，羊)，比较气雾和血管注入两种方式给予Mch刺激后发现，动物对气雾给予的Mch刺激反应低下，而对血管注入的Mch刺激气道反应明显增高，推测可能是由于气道黏液过度分泌导致气道黏膜渗透性降低从而使通过气雾给予Mch刺激所测得的气道反应低于其真实值。因此，本实验测得的大鼠对气雾给予的Mch刺激的反应低下与大动物对气雾给予的Mch刺激反应低下是一致的。

本研究采用反复气道内滴入 LPS诱发大鼠气管支气管的慢性炎症及肺实质的损伤，以期建立大鼠COPD模型。实验结果表明，模型组不仅出现了COPD典型的病理学改变，如肺内炎症细胞的浸润，杯状细胞化生，气道壁的增厚及肺泡腔的扩大，还出现了肺功能的改变，如 RL的明显增大，Cdyn的显著下降，表明存在气流阻塞。本模型制作简便经济，可以用于COPD实验研究。

(本文图4～6见彩插7。)

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Establishment of a rat model of chronic obstructive pulmonary disease by intratracheal instillation of lipopolysaccharide

LIU Jun-bo，HUANG Meng-shan，YU Chen-xi，WANG Yan，TANG Fa-di
(Zhejiang Research Laboratory of Respiratory Drugs，College of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

Objective To establish and evaluate the feasibility of a rat model of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)induced by intratracheal instillation of lipopolysaccharide(LPS).Methods LPS or saline was instilled intratracheally in rats once a week for consecutive 8 weeks.The rats were anesthetized and taken for the measurement of lung resistance(RL)and dynamic compliance(Cdyn).Total and differential white blood cell counts in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were carried out.The pathological changes of the lung tissues were observed using HE and AB-PAS staining，and the mucin 5AC content was measured.Results Intratracheal instillation of LPS caused a significant increase in RL(87.5%)and decrease in Cdyn(16.4%).Total and differential white blood cell counts in BALF such as neutrophils，lymphocytes and macrophages were higher in the LPS-treated rats.Chronic bronchitis and emphysematous changes were observed as well.Conclusion A typical rat model of COPD can be induced by repeated intratracheal instillation of LPS，showing many features of human COPD in the lung function，BALF cytologic and pathologic changes.

Chronic obstructive pulmonary disease;Lipopolysaccharide;Rat;Model

Q95-33

A

1005-4847(2011)02-0129-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.010

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是严重危害人类健康的一组常见病，病死率和致残率均较高，其防治研究早已受到国内外学者的普遍关注。众所周知，吸烟是 COPD最主要的致病因素，现有的COPD动物模型也多是通过被动吸烟所建立的，但是越来越多的研究表明，某些职业性暴露(如有机粉尘等)也是COPD形成的重要原因［1，2］，而这些职业性暴露的活性成分就是细菌内毒素［3，4］。慢性支气管炎是由于感染或非感染因素引起气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症，以慢性支气管炎或肺气肿和气流阻塞为特征的COPD是老年常见呼吸系统疾病。鉴于脂多糖(LPS)的环境或职业性暴露与支气管的慢性非特异性炎症及COPD的形成与发展有关，我们考虑通过反复气道内滴入LPS的方法摸索建立大鼠 COPD 模型［5-7］。

浙江省中医药重点项目研究计划资助项目(2008ZA014)。

刘君波，女，在读硕士研究生。

唐法娣，Email： fadit@zju.edu.cn，Tel：13656667396

2010-07-20