姜黄素对高氧致新生鼠支气管肺发育不良的保护作用

张 钰，韦 红，王小玲，张晓萍

(重庆医科大学1.附属儿童医院新生儿诊治中心;2.儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室，重庆 400014)

姜黄素对高氧致新生鼠支气管肺发育不良的保护作用

张 钰1，韦 红1，王小玲1，张晓萍2

(重庆医科大学1.附属儿童医院新生儿诊治中心;2.儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室，重庆 400014)

目的 研究姜黄素对高氧暴露致新生鼠支气管肺发育不良的影响，探讨其作用机制。方法 给予出生6 h内的SD大鼠持续60%氧暴露14d建立肺损伤模型，通氧的同时予姜黄素100 mg/(kg·d)灌胃。观察肺组织病理学改变，进行辐射状肺泡计数(RAC)，末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP缺口标记技术(TUNEL)检测肺组织细胞凋亡，免疫组化和Western blot法检测肺组织活化半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达。结果 与空气对照组相比，随着氧暴露时间的延长，高氧组的大鼠出现肺发育停滞的典型病理表现：肺泡增大、结构简化，肺泡隔增厚。RAC明显减少，肺组织细胞凋亡明显增加，免疫组化和Western blot法均显示肺组织活化Caspase-3表达明显升高。姜黄素能改善损伤的肺病理结构，并在干预14d后使RAC显著增多，肺组织凋亡细胞显著减少，干预4d后肺组织活化Caspase-3显著降低。结论 姜黄素可减轻高氧暴露所致的BPD，可能是通过抗凋亡机制实现其保护作用。

高氧症;支气管肺发育不良;姜黄素;半胱氨酸蛋白酶类;新生大鼠

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是新生儿尤其是早产儿常见的慢性肺部疾病，迄今尚无确实有效的预防措施与治疗方法。早产儿生后辅助性高浓度氧疗是BPD发生的重要因素之一，长期高氧暴露可致肺组织细胞过度凋亡［1］，导致肺损伤以及损伤后的异常修复，引起肺发育受阻。

姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种酚类物质，具有广泛的药理作用［2］。近年大量研究指出，在合适的剂量范围内姜黄素具有抗多种因素所致的细胞凋亡作用［3］。姜黄素对多种急慢性呼吸系统疾病如 ARDS、COPD具有保护作用［4］，但姜黄素对 BPD是否有保护作用、对高浓度氧所致的细胞凋亡是否有抗凋亡效应国内外尚未见报道。本研究旨在建立60%氧暴露所致的新生鼠BPD动物模型，探讨姜黄素对BPD的保护作用，并从细胞凋亡角度探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：孕15d SPF级SD大鼠20只，由重庆医科大学实验动物中心提供【SCXK(渝)2007-0001】。分笼单独饲养至分娩，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 药品与主要试剂：姜黄素(C7727，Sigma，美国)。兔抗大鼠活化 caspase-3多克隆抗体(AB3623，Millipore，美国);免疫组化羊抗兔二抗试剂盒(SP-9001，北京中杉金桥公司);二甲基联苯胺(DAB)染色试剂盒(CW0119，北京康为世纪公司)。总蛋白提取试剂盒(KGP250，南京凯基公司);二辛可宁酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒(Pierce，美国);增强化学发光法(ECL)试剂盒(Pierce，美国)。TUNEL分析试剂盒(Roche，德国)。

1.1.3 主要仪器：便携式数字测氧仪(CY2100，浙江建德仪器设备厂)，Olympus BX51显微镜，Chemi-DocXRS图像采集系统(Bio-Rad，美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与处理：按随机数字表法将出生6 h内体重相近的大鼠分为空气对照组(Ⅰ组);高氧组(Ⅱ组);高氧 +溶剂对照组(Ⅲ组);高氧 +姜黄素组(Ⅳ组)，每组20只。其中Ⅲ组：通氧的同时给予0.5%羟甲基纤维素钠溶液灌胃10 mL/(kg·d)，每日1次(qd);Ⅳ组：通氧的同时给予姜黄素的混悬液10 mL/(kg·d)，qd灌胃(混悬液配制：100 mg/kg姜黄素粉末混悬于0.5%羟甲基纤维素钠溶液，现用现配，避光保存)。

1.2.2 动物模型的制备：参照文献［5］将高氧各组新生鼠10～12只每窝连同代母鼠一起置入温度为25～26℃，湿度60% ～65%的自制氧箱内。以测氧仪控制氧浓度;箱内放入钙石灰吸收CO2，防止箱内CO2浓度过高。空气组置于同一室内空气中，饲养条件同高氧组。每天开箱1 h，新生鼠称重，将氧箱中的母鼠与空气对照组互换防止母鼠氧中毒，并更换饲料、水和垫料。某一组鼠死亡后，将其余组去掉相同数目的新生鼠，以保持各组鼠数目相同，防止因营养因素引起的差异。

1.2.3 标本收集与处理：通氧4、14d后分别从各组随机抽取10只大鼠，腹腔注射 10% 水合氯醛(0.3 mL/g)麻醉。剖开胸腔，气管插管保持肺充气状态，于右心尖穿刺，37℃生理盐水灌注肺直至白色。结扎右支气管，迅速切取右肺，液氮速冻后冻存于-80℃冰箱用于Western-blot检测;从左支气管注入预冷的4%多聚甲醛至肺膨胀至肺尖，取左肺放入多聚甲醛固定液中固定24 h后，制作石蜡切片(厚度4 μm)，用于病理学分析和免疫组化检测。

1.2.4 肺组织形态学观察：每例标本取连续的石蜡切片3张，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察各组鼠的肺组织病理学改变。每张切片随机取不重叠的5个视野(×200)，以15个视野的相应指标均值作为该例标本的RAC测定值。RAC测定参照文献［6］从呼吸性细支气管中心至最近纤维隔或胸膜引垂线，计数该垂线上的肺泡数即辐射状肺泡计数。

1.2.5 肺组织细胞凋亡原位检测：采用TUNEL法。每例标本取2张连续的石蜡切片，严格按说明书操作，以不加 TdT者为阴性对照。DAB显色，胞核棕黄色者为阳性细胞。光镜下(×400)每张切片随机取5个非重叠视野，计算每个视野的凋亡指数(apoptotic index，AI)，AI= 阳性细胞数/总细胞数×100%，再计算均值。

1.2.6 活化caspase-3免疫组织化学法检测：采用免疫组化 SP法，以 PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，以胞质中出现棕黄色颗粒沉着为阳性表达。每例标本取2张连续的石蜡切片，光镜下(×400)每张切片随机选取5个视野 ，应用 Image-pro plus 6.0图像分析软件进行分析各视野染色区域的平均吸光度值(A)，最后取10个视野的平均值作为该例标本的A值。

1.2.7 活化 caspase-3 Western-blot检测：按蛋白提取试剂盒说明书，提取肺组织总蛋白(每100 mg组织加入500 μL裂解液)，BCA法蛋白定量。选择 β肌动蛋白(β-actin)作内参;蛋白变性后取20 μL待测蛋白按序加样电泳;电泳结束后转膜。TBS液室温封闭1 h;加入一抗(兔抗大鼠活化caspase-3多克隆抗体，1∶500)4℃孵育过夜;加入HRP标记的二抗(山羊抗兔IgG抗体，1∶5000)室温孵育2h。ECL化学发光后采集图像，采用Quanty One4.62进行图像分析后作蛋白相对表达量分析。

2 结果

2.1 肺组织形态学改变

2.1.1 一般病理学改变：I组大鼠随鼠龄增加肺组织发育逐渐成熟。Ⅱ、Ⅲ组大鼠氧暴露4 d后肺泡结构紊乱，肺泡增大，间隔增厚，间质轻度充血、水肿，少量炎症细胞浸润;氧暴露14 d后肺泡腔扩大、结构简化，间隔增厚，肺泡数量减少。IV组大鼠干预4 d后肺组织充血、水肿及炎症程度减轻，但与I组相比肺组织结构未见明显改善;干预14 d后肺泡结构紊乱情况较II、III组减轻，肺泡数量增多，肺泡腔缩小。见图1(彩插6)。

2.1.2 辐射状肺泡计数(RAC)：Ⅰ组随肺发育成熟，RAC逐渐增多。Ⅱ、Ⅲ组随暴露天数增加 RAC亦逐渐增加，但与I组相比，RAC在各时间点均明显减少。与Ⅱ组、Ⅲ组相比，氧暴露加用姜黄素干预4 d后，IV组RAC无明显变化;干预14 d后，RAC明显增加，但仍低于 I组(P ＜0.01)。见图2(彩插6)。

2.2 肺组织细胞凋亡指数的变化

Tunel染色显示，I组仅见少量阳性细胞，且阳性细胞多为肺间充质细胞。与之相比，II组、III组在氧暴露4、14d后凋亡指数明显升高，且阳性细胞主要见于肺泡、小气道上皮细胞以及血管内皮细胞。与II组、III组相比，氧暴露加用姜黄素干预4d后，IV组凋亡指数无明显变化;干预14d后，凋亡指数明显降低，但仍高于I组(P ＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠肺组织凋亡指数(AI)和活化caspase-3免疫组化检测结果Tab.1 Apoptotic index(AI)and activated caspase-3 immunoreactivity scores( s，n=10)

表1 各组大鼠肺组织凋亡指数(AI)和活化caspase-3免疫组化检测结果Tab.1 Apoptotic index(AI)and activated caspase-3 immunoreactivity scores( s，n=10)

注：同一时间点内比较：**P ＜0.01 vs.Ⅰ组;△P ＞0.05 vs.Ⅱ 组;▲▲P ＜0.01 vs.Ⅱ 组Note：At the same time point：**P ＜0.01 vs.groupⅠ; △P ＞0.05 vs.groupⅡ;▲▲P ＜0.01 vs.GroupⅡ.

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2.3 肺组织活化 Caspase-3蛋白表达的变化

免疫组化染色见活化caspase-3广泛表达于肺泡、支气管上皮细胞和血管内皮细胞胞质中，阴性对照无阳性染色。与 I组相比，氧暴露4、14 d后，Ⅱ组、Ⅲ组中其表达均明显升高。与Ⅱ组、Ⅲ组相比，氧暴露加用姜黄素干预4、14 d后，Ⅳ组中其表达均明显降低，但仍高于Ⅰ组(P ＜0.01)。Western blot检测活化caspase-3的结果与免疫组化检测结果基本一致。图3见彩插6。

3 讨论

合适的动物模型是研究疾病发病机制和防治措施的基础。大量动物实验证实单一高氧因素刺激即可模拟人类BPD的大多数病理改变［7］，但目前国内外尚无统一的高氧浓度划分标准，研究指出60%的氧暴露动物模型的病理改变更符合人类新型BPD的病理特点［8］。大鼠的肺发育过程具有与人类相似的时序性，不同的是其肺发育的最后一个阶段肺泡化期于生后3 d开始，新生鼠出生时的肺发育程度相当于人类28周龄的胎肺，生后两周大鼠肺泡基本发育成熟。因此，本研究予新生鼠60%的氧暴露14 d干预其肺泡化过程建立BPD动物模型，观察高氧暴露对肺发育的影响，探讨姜黄素对BPD的保护作用。

本研究结果显示未成熟的大鼠肺组织暴露于高氧环境14 d后，出现典型的肺发育停滞的病理表现：肺泡增大、结构简化，肺泡间隔增厚。评价肺泡发育程度的重要指标RAC在氧暴露4 d后即比空气对照组明显减少，随鼠龄增加，RAC反而减少，间接证明肺泡数目减少，进一步证实高氧暴露可致肺发育停滞。而用姜黄素干预4 d后，氧暴露组大鼠肺组织炎症程度减轻，随干预时间的延长，肺组织病理结构改善，肺泡腔缩小，肺泡间隔变薄，RAC明显增多，提示姜黄素对高氧暴露所致的新生鼠肺损伤具有保护作用。

凋亡在正常肺发育过程中对肺泡形成、肺泡壁变薄以及气体交换屏障的建立等起重要作用，但肺发育关键时期肺组织细胞的过度凋亡可干扰正常肺发育进程，造成损伤组织异常修复，导致肺纤维化。Caspase-3是凋亡发生的多条路径的最终执行者，它的激活直接导致细胞凋亡的发生，该酶是否被激活可作为鉴别凋亡发生与否的重要标志之一［9］。本研究结果显示氧暴露组鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞活化 caspase-3表达明显升高，TUNEL阳性细胞比空气组明显增多，且在高氧暴露急性期(暴露4d)组织细胞凋亡更为显著，慢性期(暴露14d)凋亡效应仍较强。高氧暴露早期肺组织细胞大量凋亡可能是机体对高氧刺激的一种应激反应，以清除过多的损伤、坏死组织细胞，从而限制炎症反应，试图使肺结构恢复正常［10］。高氧暴露14d肺组织仍有大量凋亡细胞，可能与肺损伤修复延迟，大量成纤维细胞增生有关。

给予大鼠100 mg/(kg·d)的姜黄素干预后，我们发现氧暴露大鼠肺组织凋亡指数明显降低，凋亡执行蛋白caspase-3表达显著减少，提示姜黄素可通过抗凋亡机制减轻高氧暴露所致的新生鼠肺损伤。研究证实高氧可致大量活性氧(ROS)在肺组织堆积，堆积的ROS可对细胞蛋白质和DNA产生不可逆性损伤，ROS是细胞凋亡的重要介质之一［1］，已有研究提示姜黄素可通过抗氧化作用清除组织细胞内过多的ROS［11］。因此姜黄素可能通过对高氧暴露组织中ROS的清除发挥其抗高氧所致细胞凋亡的作用，其具体作用机制有待进一步研究。

(本文图1～3见彩插6。)

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Curcumin attenuates bronchopulmonary dysplasia induced by hyperoxia in neonatal rats

ZHANG Yu1，WEI Hong1，WANG Xiao-ling1，ZHANG Xiao-ping2
(1.Neonatal Diagnosis and Treatment Center of Children’s Hospital;2.Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood，Ministry of Education，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China)

Objective To investigate the effect of curcumin on bronchopulmonary dysplasia induced by hyperoxia in neonatal rats and explore its potential mechanism.Methods Eighty SD newborn rats were randomly divided into 4 groups： room air group，hyperoxia group，hyperoxia+vehicle group，hyperoxia+curcumin group.Pathomorphology of the lungs was observed with hematoxylin-eosine staining.Cell apoptosis in the lung tissue was detected by TUNEL staining.The expression of activated caspase-3 was detected by immunohistochemistry and Western blotting.Results Compared with the normoxic group，rats exposed to hyperoxia showed a histological pattern of alveolar simplification characterized by the presence of larger and fewer distal air spaces.In addition，the radial alveolar counting(RAC)was significantly lower and attenuated with curcumin treatment for 14 days.Hyperoxia exposure also resulted in significant cell apoptosis，which was reduced after treatment with curcumin.Both immunohistochemistry and Western blot demonstrated an increased expression of activated caspase-3 in the lung tissue after hyperoxia exposure，which was reduced by curcumin treatment for 4 days.Conclusion Curcumin alleviates bronchopulmonary dysplasia induced by hyperoxia in neonatal rats，probably via antiapoptotic mechanisms.

Hyperoxia;Bronchopulmonary dysplasia;Curcumin;Caspase-3;Neonatal rat

Q95-3，R722

A

1005-4847(2011)02-0120-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.008

重庆市自然科学基金资助项目(编号：CSTC2007BB5326)。

张钰(1985-)，女，研究方向：围生期肺发育与肺损伤，Email：smile284521@sina.com。

韦红，副教授，Email：waehong@sina.com.

2010-09-19