Uncv无毛小鼠无毛基因的分子克隆及序列分析

李爱学，孙兆增，尚世臣，王 鹏，姚晓兰，曾 林

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

Uncv无毛小鼠无毛基因的分子克隆及序列分析

李爱学，孙兆增，尚世臣，王 鹏，姚晓兰，曾 林

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

目的 探讨Uncv无毛小鼠的无毛性状与无毛基因 (hairless gene，hr)的相关性。方法 参照Gen-Bank上公布的小鼠的hr序列，设计5对引物，用RT-PCR方法对本单位培育的Uncv无毛小鼠hr的编码区序列进行了克隆与分析。结果 获得了Uncv无毛小鼠及野生型hr的全部编码区序列 (3546 bp)。Uncv无毛小鼠hr基因与野生型小鼠hr基因的长度及序列完全一致，同源性为100%。与GenBank上发表的国外小鼠hr基因序列(Z32675)相比，同源性为99.7%，共10个碱基发生了突变，其中2个碱基突变导致了相应的氨基酸突变;和昆明小鼠的hr(AY547391)相比，同源性为99.6%，共12个碱基发生了突变，其中3个碱基突变导致了相应的氨基酸突变;但这些突变是由种属差异造成的。结论 Uncv无毛小鼠的无毛性状产生与hr基因无关。

Uncv小鼠;无毛基因;分子克隆;序列分析

1 材料和方法

1.1 实验材料

Uncv无毛小鼠及BALB/c小鼠各4只，由本中心提供［SCSK(军)2002-001］。Trizol购自 Invitrogen公司;ReverTra Ace-α-试剂盒为 Toyobo公司产品，DEPC为Promega公司产品;凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自杭州 BioFlux公司;LA-Taq、dNTP、Oligo(dT)、pMD18-T 克隆载体、EcoR Ⅰ及HindⅢ内切酶均为大连宝生物公司产品;E.coli DH5α感受态为北京博迈德公司产品。

1.2 引物设计及合成

根据GenBank上发表的小鼠无毛基因(hr)序列(GenBank登录号：Z32675)设计5对重叠引物，分别命名为 AF、BF、CF、DF和 EF，引物序列及在无毛基因上的位置见表1，用于扩增无毛小鼠及BALB/c小鼠无毛基因的全部编码区。因无毛基因编码区序列较长(3546 bp)，在其中间位置又设计一特异性反转录引物 TF，序列为：acctgttttctccctgttct(1883-1902)。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。

表1 扩增无毛基因编码区序列所用的引物Tab.1 PCR primers for the amplification of CDS sequence of hr gene

1.3 实验方法

1.3.1 Uncv无毛小鼠皮肤组织 RNA的提取：取4只7日龄无毛小鼠，处死后各无菌取200 mg皮肤组织放入用DEPC水处理过的5 mL离心管中，加入适量液氮，用玻棒研磨至粉末状。加入1 mL Trizol，按Trizol试剂说明书提取总RNA。

1.3.2 Uncv无毛小鼠hr基因的RT-PCR扩增：以提取的总RNA为模版，以特异性引物及olig(dT)为反转录引物，用ReverTra Ace-α-试剂盒进行反转录，反转录条件为：42℃ 1 h，95℃ 5 min，4℃ 5 min。然后各以 4 μL反转录产物为模版，以设计的五对DNA序列为引物，用LA Taq进行PCR扩增，其中，以特异性引物的反转录产物为模版扩增hr基因的AF和BF段，以 olig(dT)的反转录产物为模版扩增hr基因的CF、DF、EF段。扩增条件为：预变性95℃5 min;循环条件为95℃ 30 s，退火温度为51～56℃(表 1)，40 s，72℃ 延伸 40 ～ 90 s;最后 72℃ 延伸 7 min。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果，并用凝胶回收试剂盒回收基因片段。

1.3.3 Uncv无毛小鼠 hr基因的克隆、鉴定及测序：纯化的PCR产物与 pMD18-T载体连接。连接产物转化至DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取单个白色转化菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，利用质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR方法和EcoR I和Hind III双酶切的方法筛选阳性重组子，每个片段各选四个阳性重组子送北京鼎国生物工程公司测序。

1.3.4 BALB/c小鼠hr基因的分子克隆及测序：取4只7日龄BALB/c小鼠，按上述方法同样提取皮肤组织RNA，进行RT-PCR扩增，并将阳性重组子测序。

1.3.5 序列分析：利用DNAMAN软件编辑测序列，将Uncv无毛小鼠的hr基因序列与BALB/c小鼠的hr基因进行对比分析，并与GenBank上已公布的国外小鼠和昆明小鼠的hr序列进行比较。

2 结果

2.1 Uncv无毛小鼠皮肤组织总RNA的提取

按照Trizol试剂说明书，成功的从无毛小鼠皮肤组织中提取到总RNA，rRNA的三条带比较明显，没有明显的降解。结果如图1所示。

图1 无毛小鼠皮肤组织总 RNA的提取结果(1，2，3，4为四个不同的样品)Fig.1 The results of total RNA extraction from the skin of Uncv mice(1，2，3，4 represent the four samples).

2.2 无毛小鼠hr基因的RT-PCR扩增

以无毛小鼠皮肤组织中提取的总RNA为模版，进行反转录反应。然后，分别以表1中所列的5对DNA序列为引物，以特异性引物的反转录产物为模版扩增hr基因的 AF和 BF段，以 olig(dT)的反转录产物为模版扩增hr基因的CF、DF、EF段。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的PCR扩增产物长度与预期片段的大小一致(图2)。

图2 无毛小鼠hr基因的RT-PCR扩增结果Fig.2 RT-PCR results of hr gene of Uncv mice

2.3 重组质粒的酶切和PCR鉴定

用EcoR I、HindⅢ进行重组克隆质粒的双酶切分析，并以重组克隆质粒为模板进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得了无毛小鼠hr基因5个片段的阳性重组质粒(图3)。

图3 无毛小鼠hr基因5个片段的阳性质粒鉴定结果Fig.3 Identification of positive plasmids for the five fragments of hr gene of Uncv mice

2.4 BALB/c小鼠hr基因的分子克隆

以同样方法对BALB/c小鼠的hr基因进行分子克隆，扩增得到了BALB/c小鼠hr基因的5个片段(AF－EF)。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的PCR扩增产物长度与预期片段的大小一致(图4)。同样与 pMD18-T载体连接，经蓝白斑筛选及鉴定后，将阳性重组子送公司测序。

图4 BALB/c小鼠hr基因的 RT-PCR扩增结果Fig.4 RT-PCR results of hr gene of BALB/c mice.

2.5 序列分析

阳性质粒经序列测定后，将5个片段的测序结果进行拼接，获得Uncv无毛小鼠 hr基因的完整编码区序列，无毛小鼠的hr基因全长为3546 bp，编码1182个氨基酸。同样获得了 BALB/c小鼠hr基因的全部编码区序列，序列分析表明，两种小鼠hr基因的编码区长度及序列完全一致，同源性为100%。Uncv小鼠无毛基因编码区序列与GenBank上发表的国外小鼠无毛基因(Z32675)相比，同源性为99.7%，共有10处不同的地方，分别为：在909和1557位置发生了G→A突变，在987和3437位置发生了A→G突变，在1352、1875及2223位置发生了T→C突变，在1470和1788位置发生了C→T突变，在2677位置发生了A→T突变。其中1352位置的突变导致了由异亮氨酸 突变为苏氨酸，在3437位置的突变导致了酪氨酸突变为半胱氨酸。其他的碱基突变没有导致氨基酸的变化。与国内报道的昆明小鼠无毛基因(AY547391)相比，同源性为99.6%，共有12处碱基突变，分别是：909、1557位置发生了G→A突变，987、3437位置发生了 A→G突变，1236、1352、1875位置发生了 T→C 突变，1470、1788、2538位置发生了 C→T突变，1528、2677位置发生了A→T突变。其中1352位置的突变导致了由异亮氨酸突变为苏氨酸，1528位置的突变导致了由苏氨酸变为丝氨酸，3437位置的突变导致了由酪氨酸变为半胱氨酸。

3 讨论

无毛基因hr是目前研究较多的、与皮肤和被毛的发生及结构有重要关联的核受体基因。Cachon-Gonzalez等［6］于1994年首次克隆出小鼠的无毛基因，随后人［7］、大 鼠［10］、猴［11］等 物 种 的 无毛基因相继被鉴定。该基因突变会导致毛发生长调控的紊乱，诱导毛母质细胞调亡增多，最终形成毛发丧失［12］。无毛蛋白主要在毛囊、表皮和脑组织中表达［13，14］，其确切功能还不太清楚。鉴于无毛基因在皮肤和被毛的发生及结构中的重要作用，本文通过RT-PCR方法对本单位育成的Uncv无毛小鼠的无毛基因进行了分子克隆和序列分析，探讨Uncv无毛小鼠的无毛突变与无毛基因hr的相关性。

本实验获得的 Uncv无毛小鼠的 hr基因与GenBank上发表的国外小鼠 hr(Z32675)相比，同源性为99.7%，共有10个碱基发生了突变，其中2个碱基突变导致了相应的氨基酸突变;和国内昆明小鼠的 hr基因序列(AY547391)相比，同源性为99.6%，共有12个碱基发生了突变，其中3个碱基突变导致了相应的氨基酸突变;然而，与野生型BALB/c小鼠的hr基因序列相比，长度及序列完全一致，同源性为100%。表明Uncv无毛小鼠与国外小鼠及昆明小鼠的hr基因比较，所发生的突变是由于种属差异造成的，这些突变不是导致Uncv无毛小鼠发生无毛突变的原因，Uncv无毛小鼠的无毛性状产生与hr基因无关，其突变机制还需进一步研究。

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Cloning and sequence analysis of hairless gene of Uncv hairless mice

LI Ai-xue，SUN Zhao-zeng，SHANG Shi-chen，WANG Peng，YAO Xiao-lan，ZENG Lin
(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China)

Objective To explore the correlation of the hairless nature of Uncv hairless mice with the hairless gene(hr).Methods Based on the nucleotide sequence of hr gene of mice published in GenBank，five pairs of primers were designed and the CDS sequence of the hr gene of Uncv mice were cloned by RT-PCR.Result A full-length CDS sequences(3546 bp)of the hr gene of Uncv mice and wide-type BALB/c mice were obtained.The length and sequence of hr gene of Uncv mice were fully consistent with that of BALB/c mice，and the homology was 100%.Compared with the hr gene(Z32675)of mice reported in GenBank，the homology of nucleotide sequence was 99.7%.Ten bases mutated in the hr gene of Uncv mice，and two of them altered the amino acids encoded.Compared with hr gene(AY547391)of Kunming mice，the homology of nucleotide sequence was 99.6%.Twelve bases mutated in the hr gene of Uncv mice，and three of them altered the amino acids encoded.But these mutations were resulted from species differences.Conclusion The hairless nature of Uncv hairless mice is not induced by the mutation of hr gene.

Uncv mice;Hairless gene;Cloning;Sequence analysis

Q95-33，S857.2

A

1005-4847(2011)02-0107-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.005

军事医学科学院实验动物中心在饲养的BALB/c生产群中偶然发现一对被毛稀疏的突变鼠［1，2］，其后代出现 3 种表型：全毛、稀毛、无毛。其中无毛小鼠具有毛囊发育障碍、终生被毛缺失的特征，是研究人的脱发、斑秃等毛发疾病的理想模型。该无毛突变被命名为Uncovered，符号为Uncv，该命名已经获得国际遗传标准化命名国际委员会(ICSGNM)认可，并被小鼠基因组数据库(MGD)收录。

无毛基因(hr)是由于多种无毛小鼠的无毛突变均发生于该段而得名［3］，是与皮肤和被毛结构有重要关联的核受体基因。它编码一个潜在的锌指结构转录因子［4］，调控出生后第一次毛发生长周期的转换，对毛囊细胞增殖、分化和凋亡的平衡及保持毛乳头和上皮的完整性具有重要作用［5］。该基因由19个外显子和18个内含子组成，编码1182个氨基酸，蛋白质的分子量约为127 ×103［6］。人和小鼠的无毛基因突变可导致全部或部分的毛发丧失［7，8］。无毛基因敲除可导致皮肤脱毛并出现严重的皱褶［9］。鉴于无毛基因在皮肤和被毛的发生及结构中的重要作用，本文对本单位育成的Uncv无毛小鼠及其野生型小鼠的无毛基因进行序列克隆和分析，以期获得无毛基因的全部编码区序列，研究Uncv无毛小鼠无毛性状产生与无毛基因的关联性。

国家自然科学基金重点项目(31030058);国家自然科学基金(30970416);军事医学科学院实验动物中心青年基金项目(QN2010-003)。

李爱学(1978－)女，博士，研究方向：实验动物学。Email：lax200178@yahoo.com.cn。

曾林(1965－)男，研究员，博士生导师，研究方向：实验动物科学与管理。Email：zenglin1965@126.com。

2010-09-15