细菌芽胞染色方法改进研究

叶生梅，高威

(安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000)

细菌芽胞染色方法改进研究

叶生梅，高威

(安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000)

改进微生物学实验教材上介绍的Schaeffer-Fulton氏芽胞染色法。将涂片的初染用水浴蒸汽加热和烘箱加热，通过显微镜观察不同温度下不同染色时间的染色效果。以5%孔雀绿为染色剂，100℃蒸汽加热4 min或80℃蒸汽加热6 min能达到好的染色效果。改进方法操作简单易行，加热过程不需添加染料，更符合环保要求;将改进的染色方法运用于微生物学实验教学，收到了良好的教学效果。

细菌;芽胞染色;改进

芽胞是某些细菌(主要是芽胞杆菌属和梭菌属细菌)生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子。是否产生芽胞及芽胞的形状、着生部位、芽胞囊是否膨大等是细菌分类的主要指标［1］。芽胞染色是细菌分类的重要指标，是本科院校开设微生物课的专业学生必须熟练掌握的微生物染色技术，现有的微生物实验教材上介绍的染色方法是Schaeffer-Fulton氏染色法或改良的Schaeffer-Fulton氏染色法［2-6］。我们在以往的实验教学中采用Schaeffer-Fulton氏法染色效果较好，但存在以下问题:①加热过程温度无法控制，操作中易使涂片干涸，需反复多次补加染料，染色后涂片上有染料结晶，且因染料使用多造成较多染料废水污染环境;②用夹子夹住载玻片操作，在酒精灯或电炉上加热过程中，如果夹子控制不好，就易将染料洒到酒精灯、电炉、实验台甚至学生的衣服上。改良的Schaeffer-Fulton法使用高浓度菌悬液滴加染料，沸水浴加热染色15～20 min，学生制片时涂片上菌体少，由于加热时间长，可能对芽胞囊和菌体结构有影响，复染时芽胞囊和菌体着色浅，实验效果不理想。鉴于Schaeffer-Fulton氏染色和改良的Schaeffer-Fulton氏染色存在的问题，有一些学者对此进行过改进研究［7］:如将涂片的初染放在铜板上，用酒精灯加热。本研究将涂片的初染用水浴蒸汽加热染色和烘箱干热染色(温度可以控制的条件下)，通过观察不同温度下不同染色时间的染色效果，优化筛选最佳的加热方法、合适的温度和适宜的加热时间，试图改进现有的芽胞染色方法，使芽胞染色操作简单易行同时又减少染料废水的排放。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis);从土壤中分离的芽胞杆菌菌株5株(编号为JZ-1、JZ-2、JZ-3、JZ-4、JZ-5)，未鉴定，均为本室保藏。

1.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基。

1.1.3 染色剂5%孔雀绿水溶液、2.5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液。

1.1.4 仪器设备HH-6型电热恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司;DSX-280B型高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂; PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂;DHG-9143BS-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司;YLE-21DV显微影像分析系统(主要技术参数:1130万像素数码CCD、数据分析软件、YLD显微数码影像分析软件、最高分辨率1280×1024)，北京亚力恩机电技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 芽胞染色操作步骤取37℃培养24 h的斜面菌种，常规涂片、干燥、固定—染色(初染)—水洗—复染(番红染色2 min)—水洗—镜检(涂片干燥后油镜观察并显微摄像)。

1.2.2 芽胞染色初染的加热方法按常规方法制作一系列涂片，涂片上滴加3滴孔雀绿染色液，分别设置恒温水浴锅、烘箱温度为40、60、80、100℃，将涂片置于各温度下染色2、4、6、8、10 min，加热过程中若涂片上染料快干涸时补加染料，观察各温度不同染色时间的染色效果。比较干热和水浴蒸汽加热染色效果，选择适宜的加热方法、加热温度、染色时间，并与Schaeffer-Fulton氏法和改良的Schaeffer-Fulton氏法比较。确定合适的染色加热方法后将染料孔雀绿的浓度降低到2.5%染色，观察染色效果。

2 结果与分析

2.15 %孔雀绿水浴蒸汽加热染色与烘箱干热染色的比较

将37℃培养24 h的枯草芽胞杆菌按常规制片制作涂片，分别将涂片置于40、60、80、100℃下染色，每一温度下染色时间分别为2、4、6、8、10 min，水洗、复染，油镜下观察成熟的游离芽胞和形成中的芽胞着色情况，并显微摄像。各染色效果如表1所示。

表15 %孔雀绿水浴蒸汽加热和烘箱加热染色效果比较Table 1The comparison of the staining effects from heating by water steam with that from heating by oven when the smear covers with 5%malachite green dye

从表1可看出，水浴蒸汽加热染色效果明显优于烘箱干热染色，80℃水浴加热6 min，游离芽胞呈深绿色，能达到理想的染色效果，100℃染色4 min游离芽胞和形成中的芽胞深绿色，染色效果很好;而烘箱加热染色即使100℃加热10 min，虽然游离芽胞着色明显，但形成中芽胞仍然着色不明显。水浴蒸汽加热比干热加热染色效果好，可能是蒸汽的穿透力强且有潜热存在，染料易进入芽胞使芽胞着色，提高了染色效果。水浴蒸汽加热染色的另一个优点是染料不易干涸，在滴加3滴染料的情况下，80℃加热6 min和100℃加热4 min时染料不干涸，不需添加染料，但是烘箱干热过程染料易干涸，需补加染料。部分染色显微摄影见图1。

图1 枯草芽胞杆菌染色光镜观察(1000×)Fig.1Representative views of Bacillus subtilis in microscopy(1000×) a:烘箱100℃加热10 min;b:80℃水浴蒸汽加热6 min;c:100℃水浴蒸汽加热4 min; d:Schaeffer-Fulton氏染色;e:改良Schaeffer-Fulton氏染色

2.2 2.5%孔雀绿水浴加热染色效果

为节省染料、减少污染，将5%孔雀绿染料稀释1倍作为染色液进行系列染色，将37℃培养24 h的枯草芽胞杆菌按常规制片制作涂片，分别于80、100℃下用2.5%孔雀绿染色，染色时间分别为2、4、6、8、10 min，水洗、复染，油镜下观察成熟的游离芽胞和形成中的芽胞着色情况，各染色效果如表2所示。由表2可见，染料的浓度对染色效果影响很大，2.5%孔雀绿染色时需要100℃染色6 min才有明显的着色效果，100℃蒸汽加热超过4 min时需补加染料，此法虽然降低染料浓度，但要补加染料才能着色，因而非但没有减少染料使用量且染色效果不如5%染料。

综上所述，5%染料80℃染色6 min、100℃染色4 min均能达到很好的染色效果，且不需补加染料;与Schaeffer-Fulton氏染色法比较不仅染色效果好，节约染料减少染料废水，而且操作简单易行。综合考虑，选择5%孔雀绿染料80℃水浴加热染色6 min或100℃水浴蒸汽加热染色4 min，作为芽胞染色初染的最佳染色方法。

表22.5%孔雀绿水浴加热染色效果Table 2The staining effect from heating by water steam when the smear covers with 2.5%malachite green dye

2.3 几株芽胞菌株对改进方法的染色验证

表3 改进方法对5株芽胞杆菌的染色效果Table 3The staining effect of Bacillus JZ-1toJZ-5 by improved staining method

为了验证以上芽胞染色的改进方法的准确性，对从土壤中分离的5株芽胞杆菌(未鉴定)用改进方法进行染色，各菌株37℃培养24 h，常规涂片，100℃水浴蒸汽染色4 min后观察各菌株的芽胞染色效果。结果表明用改进的方法对上述几株芽胞杆菌的染色效果良好，证明该方法结果可靠。染色效果见表3、显微观察见图2。

图2 5株芽胞菌的染色效果(光镜，1000×)Fig.2Representative views of Bacillus JZ-1 to JZ-5 in microscopy(1000×)

3 小结

由于芽胞结构的特殊性，其着色不仅要加大染色剂浓度，而且要加热。用水浴蒸汽加热染色可以用5%孔雀绿为染色剂，于100℃蒸汽加热4 min或80℃蒸汽加热6 min，染色效果好。与Schaeffer-Fulton氏法比较，加热过程不需添加染料，更符合环保要求。

加热设备可用水浴锅或电炉等。用电炉加热时只需将小烧杯的水加热至沸腾，将滴有染料的涂片架在小烧杯上即可;用水浴锅加热时只需将滴有染料的涂片架在水浴锅盖孔上，染色操作简单易行。

我校微生物实验课面向生物工程、食品科学与工程、生物技术、环境工程4个专业，以往应用Schaeffer-Fulton氏法的微生物芽胞染色实验课结束，不仅酒精灯、实验台等沾上很多染料，涂片染色后水洗造成更多染料废水。我们将改进的加热方法应用于学生实验教学，收到了良好的教学效果。

［1］沈萍，陈向东.微生物学［M］.北京:高等教育出版社，2006: 53-59.

［2］沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［M］.北京:高等教育出版社，2007:76.

［3］陈金春，陈国强.微生物学实验指导［M］.北京:清华大学出版社，2005:72.

［4］赵斌，何绍江.微生物学实验［M］.北京:科学出版社，2002: 42-43.

［5］杨革.微生物学实验教程［M］.北京:科学出版社，2004:22-23.

［6］唐丽杰.微生物学实验［M］.哈尔滨:哈尔滨工业大学出版社，2005:41.

［7］袁红，倪友娣，缪利英，等.介绍一种细菌芽胞微波染色法［J］.杭州医学高等专科学校学报，2002，23(5-6):236.

Improvement of Bacteria’s Spore Staining

YE Sheng-mei，GAO Wei
(Coll.of Biol.and Chem.Engin.，Anhui Polytechnic Uni.，Wuhu 241000)

Schaeffer-Fulton’s spore staining method introduced in microbiological experiment teaching material was improved after heating the firstly stained smear by water bath steam and oven，the staining effects at different staining temperature and time were investigated through microscopic observation.The results showed that the best staining results could be achieved with 5%malachite green dye，heating by water steam at 100℃for 4 minutes or at 80℃for 6 minutes.This improved method was easy to operate and met the environmental protection requirement since no extra dye needed during the heating process.This method was put into microbiological experimental teaching，and achieved a better teaching results.

bacteria;spore staining;improvement

Q93

B

1005－7021(2011)01－0106－04

安徽省教育厅自然科学研究项目(KJ2010A349)

叶生梅女，高级实验师，硕士。主要从事微生物菌种选育研究。E-mail:ysm396@sina.com

2010-11-18;

2010-12-28