BALB/c小鼠感染不同疟原虫CD4+Th应答和凋亡特点的比较研究

郑丽，孙晓丹，潘艳艳，冯辉，陈光，周泓旭，曹雅明*

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳110001;2.中国医科大学临床医药学院医学基础教学中心，辽宁沈阳110001; 3.佳木斯大学基础医学院寄生虫学教研室，黑龙江佳木斯154000)

BALB/c小鼠感染不同疟原虫CD4+Th应答和凋亡特点的比较研究

郑丽1，孙晓丹2，潘艳艳1，冯辉1，陈光3，周泓旭1，曹雅明1*

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳110001;2.中国医科大学临床医药学院医学基础教学中心，辽宁沈阳110001; 3.佳木斯大学基础医学院寄生虫学教研室，黑龙江佳木斯154000)

探讨不同疟原虫感染BALB/c小鼠的免疫应答特点。BALB/c小鼠经腹腔注射致死型约氏疟原虫(P.y17XL)和夏氏疟原虫(P.c AS)感染的红细胞，计数红细胞感染率;ELISA动态检测感染小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平;流式细胞术检测脾中CD4+T细胞凋亡数量。约氏疟原虫(P.y17XL)感染早期，小鼠原虫血症持续上升;IFN-γ和IL-4分泌水平仅在感染后第3天出现一过性有意义的升高，而且峰值较低;脾中CD4+T细胞大量凋亡，小鼠全部死亡;而夏氏疟原虫(P.c AS)感染小鼠，原虫血症上升缓慢;IFN-γ分泌水平在感染后第5天达峰值;IL-4分泌水平在感染后第10天达峰值，且峰值较高维持时间较长;脾中CD4+T细胞凋亡细胞于感染后8 d出现有意义升高，小鼠全部存活。抗疟保护性免疫有赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡，感染期间CD4+T细胞凋亡的时相和数量可能是影响免疫应答的强度或引起宿主免疫抑制的原因，从而影响宿主疟原虫感染的结局。

BLAB/c小鼠;约氏疟原虫;夏氏疟原虫;Th应答;凋亡

疟疾是疟原虫经媒介按蚊传播的严重威胁人类健康的寄生原虫感染性疾病。2010年WHO报告，2009年全球疟疾病例超过2亿人，导致近百万患者死亡［1］，给全球尤其是发展中国家带来了沉痛的健康危害和严重的经济负担［2］。随着疟疾疫苗的开发和抗疟药物的研究进展，宿主对疟原虫的免疫机制的研究越来越成为人们关注的热点。以往的研究显示，在疟疾感染早期Th1应答的有效建立和后期Th1向Th2应答的有序过渡是不同小鼠感染同种疟原虫出现治愈和死亡的原因［3］。在疟疾感染早期，DC产生IL-12诱导IFN-γ分泌增加的Th1型细胞免疫应答，增强巨噬细胞的吞噬活性，并通过TNF-α及NOs遏制疟原虫的爆发性增殖;随之，由Th2型细胞辅助B细胞产生特异性抗体，有效清除疟原虫，防止复发和再燃［4-6］。本研究利用成功建立的约氏疟原虫(P.yoelii17XL，P.y17XL)和夏氏疟原虫(P.chabaudi AS，P.c AS)感染的BALB/c小鼠模型，对比观察了宿主的感染模式、Th1和Th2型免疫应答特点，特别是感染后宿主脾细胞CD4+T细胞凋亡的数量，以期为疟疾等感染性疾病的有效控制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物6～8周龄雌性BALB/c小鼠，中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号:SCXK6京2004-0001。

1.1.2 主要试剂RPMI 1640培养基(Thermo);小牛血清(Biological Industries，Haemek，Israel); IFN-γ和IL-4 ELISA试剂盒(R＆D System，Minneapolis，MN);抗CD4-FITC单克隆抗体(GK1.5克隆)。Annexin-V-PE apoptosis detection kit(BD Pharmigen)。

1.1.3 主要仪器自动酶标检测仪，Model 450，Bio-rad产品;FACSCalibur流式细胞仪，FACSean，美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 疟原虫及实验动物感染6～8周龄雌性BALB/c小鼠，经腹腔分别感染1×106P.y17XL和P.c AS(日本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠)寄生的红细胞(pRBC)，感染不同时间的小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，计数红细胞感染率。

1.2.2 脾细胞培养分别于感染后第0、3、5、8、10、12、15天，常规无菌取出小鼠脾脏，用RPMI 1640培养液制备浓度为1×107个/mL脾细胞悬液，于24孔培养板中培养48 h后，收集培养上清，－80℃保存，待IFN-γ和IL-4检测。

1.2.3 细胞因子检测用双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测IFN-γ和IL-4产生水平。酶标仪测定450 nm处OD值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro 4.3.1LS软件分析，计算细胞因子含量(pg/mL)。

1.2.4 流式细胞术检测脾细胞中CD4+T细胞的凋亡数量取binding buffer制备的1×106个/mL脾细胞悬液0.1 mL，加入流式细胞仪专用染色管中，每份样品设阴性对照管、CD4-FITC单标及其Annexin V-PE单标管，另一管加入抗CD4-FITC和AnnexinV-PE各5 μL。25℃避光孵育15 min，每管加binding buffer 400 μL，1 h内上机。利用流式细胞仪(FACSCalibur，美国B＆D公司)，激发波长为488 nm，利用FACS CELLQUEST软件获取细胞，每个样品分析10000个细胞，使用前向散射角(FSC)及侧向散射角(SSC)确定淋巴细胞群，以阴性对照为参考，将对照管所示的非特异荧光的99%以上作为本底扣除，以二维点阵图显示，记录CD4+T细胞凋亡的百分率。

1.2.5 统计学处理应用SPSS 11.5统计学分析软件，各组之间指标的差异性检验选用配对t检验分析，P＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种疟原虫感染小鼠的原虫血症水平及生存率

P.y17XL和P.c AS感染小鼠分别于感染后第2天和第4天，外周血中出现疟原虫感染的红细胞。随后，P.y17XL感染小鼠原虫血症水平迅速持续升高，感染后第5天达峰值约60%，小鼠于感染后第5天及次日全部死亡;相比，P.c AS感染小鼠原虫血症水平上升缓慢，感染后第8天达到峰值仅为41%左右，随后迅速下降，于感染后第14～16天自愈，小鼠生存率为100%(见图1)。

2.2 两种疟原虫感染小鼠脾细胞上清中IFN-γ和IL-4水平检测

P.y17XL感染小鼠脾细胞上清中IFN-γ水平仅在感染后第3天出现一过性有意义的升高(P＜0.01)，随后迅速下降;P.c AS感染小鼠脾细胞上清中IFN-γ水平在感染后第3天出现有意义升高，第5天达峰值(P＜0.01)，随后下降至正常水平(见图2)。P.y17XL感染小鼠脾细胞上清中IL-4水平仅在感染后第3天出现有意义升高(P＜0.05)，而P.c AS感染小鼠脾细胞上清中IL-4水平在感染后第8天出现有意义的升高，第10天达峰值(P＜0.01)，此后虽有回落但仍维持较高水平(见图3)。

图2 不同疟原虫感染BALB/c小鼠后脾细胞培养上清中IFN-γ水平Fig.2The level of IFN-γ from splenocytes supernatant of BALB/c mice infected with P.y17XL or P.c AS on different time points＊＊P＜0.01 indicate the significant difference compared with control mice(non-infected mice，0d)＊＊P＜0.01表示与正常对照组相比差异显著

图3 不同疟原虫感染BALB/c小鼠后脾细胞培养上清中IL-4水平Fig.3The level of IL-4 from splenocytes supernatant of BALB/c mice infected with P.y17XL or P.c AS on different time points *P＜0.05 and＊＊P＜0.01 indicate the significant difference compared with control mice(non-infected mice，0d) *P＜0.05和＊＊P＜0.01表示与正常对照组相比差异显著

2.3 两种疟原虫感染小鼠脾细胞中CD4+T细胞凋亡数量的检测

P.y17XL感染小鼠脾细胞中CD4+T细胞凋亡数量于感染后第3天出现有意义升高(P＜0.01)，于感染后5 d达到峰值(P＜0.01)。相比，P.c AS感染的小鼠脾细胞中CD4+T细胞凋亡数量于感染后变化不明显，仅于感染后第8天其数量和正常组小鼠相比具有统计学意义(P＜0.01) (图4)。

图4 不同疟原虫感染BALB/c小鼠后不同时间脾细胞中CD4+T细胞凋亡数量变化Fig.4CD4+T cell apoptosis in P.y17XL or P.c AS-infected BALB/c mice

3 讨论

关于红内期疟原虫感染的免疫机制，无论鼠疟模型和人体试验研究结果均已证实:CD4+T细胞在抵抗红内期疟原虫感染过程中发挥至关重要的作用，Thl-Th2连续活化是确保保护性免疫效应发挥的关键［7-8］。Thl/Th2之间的平衡及协调不但能够控制急性期的危象，而且最终能够清除疟原虫。

本研究显示在P.y17XL感染3 d后，BALB/c小鼠的原虫血症水平迅速持续上升，至感染后第5天高达60%，小鼠全部死亡，同时IFN-γ和IL-4分泌水平仅在感染后第3天出现一过性有意义的升高，而且峰值较低，这一结果提示BALB/c小鼠在疟原虫感染早期未能建立有效的Thl应答控制红内期疟原虫的爆发性增殖，导致最终死亡的感染结局。与P.y17XL相比，P.c AS生长相对缓慢，所以宿主的免疫系统对生长快慢不同的疟原虫反应就具有差异性［9］。BALB/c小鼠感染P.c AS，疟原血症于感染后第8天达到峰值仅为41%;IFN-γ分泌水平在感染后第5天达峰值，IL-4分泌水平在感染后第10天达峰值，且峰值较高维持时间较长，小鼠全部存活，这一结果提示BALB/c能够对P.c AS建立有效地Th1型免疫应答，并且成功地从Th1向Th2型应答过渡。

外来抗原刺激CD4+T细胞活化、克隆增殖后，活化的T细胞通过活化诱导性细胞死亡(AICD)方式及一种凋亡的形式完成免疫应答中的使命。细胞活化后死亡是机体维持免疫稳态的必要条件。然而细胞凋亡的数量或时相往往影响有效免疫应答的建立或免疫记忆的维持［10-11］。本研究发现，P.y17XL感染早期BLAB/c未建立有效的Th1应答，同时伴随CD4+T细胞大量凋亡，直至小鼠死亡;而P.c AS感染小鼠能够建立有效地Th1型免疫应答，并且Th1向Th2型应答有序过渡，而凋亡细胞数量于感染后8 d出现有意义升高，小鼠全部存活。这一结果提示，P.y17XL感染的BALB/c小鼠未能建立有效的抗疟应答可能与CD4+T细胞凋亡过早或过度发生有关，而P.c AS感染的BALB/c小鼠正是由于CD4+T细胞的适宜凋亡而能建立有效的Th1免疫应答，同时又有序过渡到Th2免疫应答。

综上所述，本实验对BALB/c小鼠感染不同疟原虫的免疫应答模式和应答效应进行了初步探讨，再次证实Thl和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡对抵抗疟疾感染至关重要，同时提示感染早期出现的大量细胞凋亡很可能使小鼠处于免疫抑制状态而不能建立有效的Th1应答和Th1与Th2应答的有序过渡，其相关的调节机制尚有待进一步阐明。

［1］WHO:World Malaria Report，2010.vii年度报告.

［2］Feachem RG，Phillips AA，Hwang J，et al.Shrinking the malaria map:progress and prospects［J］.Lancet，2010，376(9752): 1566-1578.

［3］Schofield J，Grau GE.Immunological processes in malaria pathogenesis［J］.Nature Immunology，2005，5:722-735.

［4］Chen G，Feng H，Liu J，et al.Characterization of immune responses to single or mixed infections with P.yoelii 17XL and P.chabaudi AS in different strains of mice［J］.Parasitol Int，2010，59(3):400-406.

［5］Iriemenam NC，Okafor CM，Balogun HA，et al.Cytokine profiles and antibody responses to Plasmodium falciparum malaria infection in individuals living in Ibadan，southwest Nigeria［J］.Afr Health Sci，2009，9(2):66-74.

［6］Zheng W，Wang QH，Liu YJ，et al.Distinct host-related dendritic cell responses during the early stage of Plasmodium yoelii infection in susceptible and resistant mice［J］.Parasite Immunol，2010，32(5):324-334.

［7］Taylor Robinson AW，PhilliPs RS，Severn A，et al.The role of Thl and Th2 cells in a rodent malaria infection［J］.Seience，1993，260:1931-1934.

［8］Mathotra I，Mungai P，Muchiri E，et al.Distinct Thl and Th2 type prenatal cytokine responses to Plasmodium falciparum erythrocyte invasion ligands［J］.Infect Immun，2005，73:3462-3470.

［9］Cheesman S，Raza A，Carter R.Mixed strain infections and strain-s pecific protective immunity in the rodent malaria Parasite Plasmodium chabaudichabaudi in mice［J］.Infect Immun，2006，74:2996-3001.

［10］Freitas do Rosário AP，Muxel SM，et al.Gradual decline in malaria-specific memory T cell responses leads to failure to maintain long-term protective immunity to Plasmodium chabaudi AS despite persistence of B cell memory and circulating antibody［J］.J Immunol，2008，181(12):8344-8355.

［11］Mukherjee P，Devi YS，Chauhan VS.Blood stage malaria antigens induce different activation-induced cell death programs in splenic CD4+T cells［J］.Parasite Immunol，2008，30(10): 497-514.

Characteristic Comparison of CD4+Th Immune Responses and Apoptosis in BALB/c Mice Infected with Different Plasmodia

ZHENG Li1，SUN Xiao-dan2，PAN Yan-yan1，FENG Hui1，CHEN Guang3，ZHOU Hong-xu1，CAO Ya-ming1
(1.Teach.＆Res.Div.of Immunol.，Coll.of Basic Med.，2.Basic Teach.Ctr.，Coll.of Clin.Med.，China Med.Uni.，Shenyang 110001; 3.Teach.＆Res.Div.of Parasotol.，Coll.of Basic Med.Jiamusi Uni.Jiamusi 154000)

Immune response characteristics in BALB/c mice infected with different plasmodia were investigated.BALB/c mice were infected by intraperitoneal injection with 1×106virulent P.yoelii 17XL or P.chabaudi AS parasitized erythrocytes，Splenocyte IFN-γ and IL-4 producing levels were measured by dynamic ELISA.The apoptosis of CD4+T cell was detected by flow cytometry.The results showed that during early stage of P.y 17XL infection，the parasitaemia of mice continuously increased and the secretion levels of IFN-γ and IL-4 appeared a transient significant increment only on d3 post-infection，though with low peak value;and a large number of CD4+T cells of spleen went apoptosis，and all mice died.However，the increment of parasitemia of mice infected with P.c AS was slow and the levels of IFN-γ reached to peak value on d5 post-infection，and IL-4 on d10 post-infection;And the time of peak value was maintained fairly long;a significant increment of the CD4+T cells of spleen apoptosis appeared d8 post-infection，and all mice survived.Therefore，protective immunity against malaria infection depended on the establishment of effective Th1 and Th2 responses and coordinative transition.The time phase and quantity of CD4+T apoptosis duringthe early infection might be a reason that affected the immune response strength and/or caused the immune of the host to inhibit，thereby affected the outcome of the host to infect the plasmodia.

BALB/c mice;Plasmodium yoelii;Plasmodium chabaudi;Th immune response，apoptosis

R392

A

1005－7021(2011)01－0019－05

国家自然科学基金(30800961)

郑丽女，讲师，博士研究生。现从事抗感染免疫工作。E-mail:zli77@yahoo.com.cn

*通讯作者。Tel:024-23256666-5346，E-mail:yamingcao@yahoo.com.cn

2011-01-16;

2011-01-20