耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行病学研究

潘宏升，田素飞，年华，褚云卓

(中国医科大学附属第一医院检验科，辽宁沈阳110001)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行病学研究

潘宏升，田素飞，年华，褚云卓*

(中国医科大学附属第一医院检验科，辽宁沈阳110001)

了解我院患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子流行病学特点，为临床抗感染治疗提供依据。收集2007年1月～2008年9月我院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌共54株，采用PCR进行SCCmec基因分型、葡萄球菌A蛋白(SPA)分型，并检测杀白细胞毒素(PVL)基因，同时应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行同源性分析。54株MRSA菌株SCCmec基因分型为SCCmecⅡ型17株，SCCmecⅢ型33株，SCCmecⅣ型2株，SCCmecⅤ型2株;SPA基因分型将28株归属为t030，9株为t002，8株为t037，5株为t570，2株为t437，t163和t796各1株;PVL毒素检测只有2株SCCmecⅣ型菌株阳性;PFGE证实院内MRSA感染主要为2种克隆株传播，同时还有其他型别出现。本院MRSA流行传播的SCCmec基因型主要以Ⅲ型占优势，同时发现有携带PVL毒素的CA-MRSA分离株流行，应引起密切关注。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;基因分型;杀白细胞毒素

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是临床非常重要的病原菌，具有多重耐药性和潜在的致死性等特点，存在局部暴发流行的潜在威胁，是临床抗感染治疗的难题之一，目前已成为医院和社区的常见致病菌，严重威胁着人类的健康。MRSA的耐药性往往与其携带多种耐药基因有关，其中携带葡萄球菌基因盒(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)的移动基因元件为其主要原因，SCCmec基因又存在不同亚型［1］。因此，了解MRSA的基因分型对临床治疗及流行病学调查具有重要意义。分子流行病学研究方法在揭示病原菌的遗传进化规律，确定某一感染暴发流行菌株的基因同源性，调查院内耐药性质粒在不同菌群间播散等方面发挥重要作用。本文应用SCCmec基因分型、SPA分型及脉冲场凝胶电泳(PFGE)等方法对中国医科大学分离的MRSA进行分子流行病学研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源收集中国医科大学附属第一医院2007年1月至2008年9月门诊及住院患者连续分离、不重复非痰标本MRSA菌株54株，mecA基因均阳性，其中血标本14份，创口分泌物13份，脓汁10份，静脉导管8份，留置管6份，引流液2份，便1份。

1.1.2 主要试剂及仪器细菌基因组提取试剂盒，博日生物技术有限公司;Taq酶及PCR相关试剂，宝泰克大连生物科技有限公司;PCR所有引物，上海生工有限公司合成;脉冲场凝胶电泳试剂盒，美国Bio-Rad生物科技有限公司。HZQ-F160振荡培养箱(上海);超速低温离心机(贝克曼); PCR9700(Gene Amp);脉冲场凝胶电泳仪(Bio-Rad);紫外凝胶成像仪(Alpha Innotech)。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取采用细菌基因组提取试剂盒，按照说明提取基因组DNA。

1.2.2 SCCmec基因分型引物设计及反应参数等参照文献［1］进行，ClassB上游引物5'-TATTTTTGGGTTTCACTCGG-3'，下游:5'-CTCCACGTTAATTCCATTAATACC-3';ClassC上游引物:5'-GAACATTGTTACTTAAATGAGCG-3'，下游引物:5'-TGAAAGTTGTACCCTTGACACC-3'; Type2上游引物:5'-ATTGCCTTGATAATAGCCTCT-3'，下游引物:5'-TAA AGGCATCAATGCACAAACACT-3'。

1.2.3 PVL基因检测引物设计及参数参照文献［2］，上游引物:5'-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3'，下游引物:5'-GCATCAACTGTATTGGATAGCAAAAGC-3'。

1.2.4 SPA基因多态性分型引物及反应条件参照文献［3］，上游引物:5'-CAGCAGTAGTGCCGTTTG-3'，下游引物:5'-GACGATCCTTCGGTGAGC-3'。

1.2.5 基因序列分析目的基因经PCR扩增阳性，片段大小与预计值相符，产物经上海生工有限公司纯化、测序，在GenBank上比对，确定为目的基因特征序列，其中SPA分型的测序结果于数据库(http://www.ridom.de/spaserver/)中公布的重复序列进行比较，根据排列方式及次数确定型别。

1.2.6 脉冲场凝胶电泳分析新鲜菌株包埋于1%低熔点琼脂中，溶葡球菌素及溶菌酶进行破壁(37℃，2 h)，蛋白激酶K原位消化(50℃，48 h)，经限制性内切酶SmaI酶切(25℃、140 r/ min、4 h);参数:电场强度6 V/cm，温度14℃，角度120°，线性变化5～40 s，22 h，EB染色20 min，分析结果。结果判定标本标准:酶切后图谱完全一致为A型;图谱与A比较，3条带差异以下者为同一型的不同亚型，4～6条者为不同基因型。

2 结果与分析

2.1 SCCmec基因分型结果

54株MRSA菌株分为SCCmecⅡ～Ⅴ型，其中SCCmecⅡ型17株(31.5%)、SCCmecⅢ型33株(61.1%)、SCCmecⅣ型2株(3.7%)及SCCmecⅤ型2株(3.7%)。

2.2 SPA基因多态性分型结果

根据重复序列出现的次数和排列方式不同，SPA基因分型分为7个型，其中28株(51.9%)为t030型(r15-r12-r16-r02-r24-r24)、8株(14.8%)为t002型(r26-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16)、8株(14.8%)为t037型(r15-r12-r16-r02-r25-r17-r24)、5株为t570型(r07-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16)、2株(3.7%)为t437型(r04-r20-r17-r20-r17-r25-r34)、t163(r04-r20-r17-r20-r17-r45-r16-r34)和t796(r07-r23-r21-r17-r12-r23-r02-r12-r23)各1株(1.9%)。

表1 菌株间SCCmec与SPA基因型结果及其关系Table 1The relationship of Strain between SCCmec and SPA

2.3 PVL基因检测

检测结果只有2株SCCmecⅣ-t437型MRSA分离株PVL基因阳性，占临床分离株的3.7%，其测序结果见图1。

2.4 PFGE结果

染色体条带电泳结果显示我院MRSA感染为多克隆株传播，至少存在4个克隆株，分别为A、B、C、D型，以A和B型为主，其中A型23株，B型19株，A型又分为A1和A2亚型，B型分为B1和B2亚型。电泳结果见图2。

3 讨论

MRSA已成为医院和社区人群感染的常见病原菌，不但致病能力强，耐药谱广，而且对多种抗菌药物的敏感性呈现逐年降低趋势［5］，目前已经成为严重危害公众健康的感染性因子之一，使临床抗感染治疗面临极大困难，由此也成为医学界关注的焦点问题。

不同国家、不同地区间流行的MRSA基因型不同，Ko等［6］报道，亚洲地区除日本和韩国以SCCmecⅡ型为主外，其他9个国家医院MRSA均以SCCmecⅢ型占优势，我国香港［7］、台湾［8］地区的报道也以Ⅲ型为主。但目前国内相关研究较少，2006年的一项国内调查研究显示，中国医科大学附属一院MRSA感染以SCCmecⅡ型为主［9］，与日本、韩国的SCCmec基因型一致。本研究发现，中国医科大学附属一院MRSA感染以SCCmecⅢ型占优势(占61.8%)，可见MRSA基因型存在由Ⅱ型向Ⅲ型转变趋势，目前，这种基因型转变的趋势尚未在其他国家和地区间出现，考虑到本地区间的基因型转变可能与以下因素有关:SCCmecⅢ型MRSA在不断进化，适应能力在逐渐提高，生存能力在日益增强;本研究标本多来源于ICU、呼吸科、感染科等病房，其患者年龄多较大，有长期用药史，抗菌药物选择压力也是不容忽视的主要原因;随着国家和地区间经济文化交流的日益频繁，使得感染更具有复杂性和多样性。诸多因素影响下的SCCmec基因型转变使得临床抗感染治疗更为棘手。尤为重要的是，本地区2007年以来已经出现了社区MRSA菌株(SCCmecⅣ型2株及SCCmecⅤ型2株)，虽然社区MRSA菌株的SCCmec基因结构上仅携带对β-内酰胺类抗菌药物耐药基因，但已有报道CA-MRSA对多重药物敏感率呈逐年下降趋势［5］，考虑后者可能涉及其他耐药机制。本研究中，CA-MRSA对红霉素、克林霉素、环丙沙星及庆大霉素等也表现出不同程度耐药，因此CA-MRSA的多重药物敏感性已在下降，耐药形势不容乐观。另外CA-MRSA菌株SCCmec片段相对小，未负载其他“额外”的耐药基因，因此，非常利于广泛传播，较易造成大范围的流行。

CA-MRSA不同于HA-MRSA的另一显著特点是其毒力较强，常携带多种与致病力相关的外毒素，Vandenesch等［10］进行相关研究，发现所有117株社区MRSA均包含pvl基因，而医院MRSA菌株pvl基因均未检测出。此研究显示pvl可能为社区基础的MRSA病原体提供了选择性的优势。本次研究中，2株SCCmecⅣ型CA-MRSA菌株pvl基因扩增均阳性，而HA-MRSA的pvl基因扩增均为阴性，回顾性分析2株CA-MRSA感染患者的临床资料，均为门诊患者，因皮肤软组织感染而接受治疗，尚无坏死性肺炎等致死性感染出现，目前有关CA-MRSA及pvl基因研究备受关注。

spa分型研究发现，2007年分离的SCCmecⅢ型MRSA菌株t030(r15-r12-r16-r02-r24-r24)，在2008年发生了基因重排，形成了克隆株t037(r15-r12-r16-r02-r25-r17-r24)。SCCmecⅡ型MRSA克隆株一直以t002(r26-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16重复单位长达10个)为主，进化缓慢，仅2007年出现了第一个重复单位内的点突变，成为t570(r07-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16);在2008年出现基因重排，演变为t3166(r26-r23-r17-r34-r17-r13-r23-r17-r34-r17-r20-r17-r12-r17-r16)。SCCmecⅣ型的spa重复序列t437(r04-r20-r17-r20-r17-r25-r34)特征提示其不同的起源。SCC-mecⅤ型则包括2种spa型别t163及t796，值得注意的是SCCmecⅤ-t163(r04-r20-r17-r20-r17-r45-r16-r34)与SCCmecⅣ-t437型克隆株之间存在特殊的关联模式。但目前关于spa基因型t796、t163报道较少，尚无法比较分析。

综合SCCmec和spa 3种基因分型结果，MRSA并非以单一克隆株占优势，而由两大克隆株(SCCmecⅢ-t030和SCCmecⅡ-t002)进化而来，并且呈交替流行的趋势，PFGE结果也证实了这一结果。因此了解MRSA的分子流行病学特点，为防控MRSA在医院和社区中的出现和蔓延具有深远影响。

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Molecular Epidemiological Study on Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

PAN Hong-sheng，TIAN Su-fei，NIAN Hua，CHU Yun-zhuo
(Clin.Lab.Dept.of The First Hosp.of China Med.Uni.，Shenyang 110001)

Molecular epidemiological characteristics of patients suffered from methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)in the hospital were penetrated in order to provide foundation for anti-infective therapy.54 strains of MRSA isolated in the hospital during January 2007～September 2008 were collected and adopted polymerase chain reaction(PCR)carried out SCCmec and Staphylococcus A protein(SPA)genotyping，as well as Panton-Valentine leukocidin(PVL)gene detection，and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)homology analysis.The results showed that SCCmec gene typing among 54 MRSA strains SCCmecⅡwas 17 strains，SCCmecⅢ33 strains，SCCmecⅣ2 strains，SCCmecⅤ2 strains;and SPA genotyping get 28 MRSA attributed to t030，9 strains to t002，8 strains to t037，5 strains to t570，2 strains to t437，and each to t163，t796.The PVL toxin detection only two SCCmecⅣstrains were positive;Nosocomial infection of MRSA was confirmed primarily spread by two cloned strains which were proved by PFGE，while occurred other types emerged.Therefore，the prevalence and spread of MRSA in the hospital mainly dominated by SCCmecⅢgenotype;And it was found at the same time that PVL toxin-carrying isolates of CA-MRSA was epidemic that should be paid a close attention to.

methicillin-resistant;Staphylococcus aureus;genotyping;Panton-Valentine leukocidin

R378.1+1

A

1005－7021(2011)01－0034－05

辽宁省科技计划项目(2008225010-10)

潘宏升男，硕士研究生。研究方向为细菌耐药机制。E-mail:phs751@163.com

*通讯作者。E-mail:cyz6630@163.com

2010-11-17;

2011-01-12