稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素提取方法研究

毛莹，任佐华，王娜，白珍安，虞选杰，刘二明

(湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南长沙410128)

稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素提取方法研究

毛莹，任佐华，王娜，白珍安，虞选杰，刘二明*

(湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南长沙410128)

探究稻曲病菌(Ustiloginoidea virens(Cooke)Takahashi)厚垣孢子壁黑色素的最佳提取方法，采用以HCl为提取剂的酸提法和以NaOH为提取剂的碱提法，对该病菌黑色和黄色2种厚垣孢子壁的黑色素进行提取，用3因素3水平进行正交设计试验，结果表明以NaOH作提取剂为佳，其提取黑色素效果最佳的组合条件为3 mol/L NaOH、2 mol/L HCl、水浴温度80℃、水浴时间120 min。

稻曲病菌;厚垣孢子壁;黑色素;提取;正交设计

稻曲病是由真菌稻绿核菌(Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi)引起的水稻穗部重要病害［1］，人或动物食用了带有稻曲病的大米或谷粒，会引起内脏器官的病变或中毒［2］。稻曲病的侵染循环，国内外观点虽然不统一，但比较一致的是，稻曲病以菌核或厚垣孢子的形式越冬。厚垣孢子有3种形态:黄色、黄绿色、黑色［3］。研究表明，黑色素是一种较为复杂的酚类聚合物［4］，存在于植物或微生物的细胞壁外围，可以保护植物或微生物对抗恶劣的环境，如紫外线、极端温度等［5］。为了研究黑色和黄色厚垣孢子壁中黑色素含量在其颜色转化中的差异，首先必须探究适宜提取稻曲病菌厚垣孢子壁中黑色素的方法。目前为止，国内外还没有专门提取稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素的报道，只有提取其他菌类黑色素的报道。提取黑色素的前提是破坏其与其他生物大分子的相互作用，有报道直接用HCl调节菌液的pH使得黑色素沉淀［6］，或用氨水、NaOH溶液作为提取溶剂［7］;有时，为了得到大量黑色素，有报道将菌体进行发酵培养，然后用NaOH溶解黑色素，再用HCl沉淀［8］。本文拟用酸、碱及相关因素开展稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素的提取方法，以期得出提取黑色素的最佳方法和条件，为进一步研究稻曲病菌厚垣孢子的生物学特性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 稻曲病厚垣孢子2009年9月4日于怀化市洪江市湾溪乡和丰村采集两优396上的典型黑色和黄色稻曲病厚垣孢子，并保存于－40℃低温冰箱中备用。

1.1.2 试剂HCl和NaOH均为国产分析纯;黑色素标准品(Sigma M8631)。

1.1.3 仪器设备紫外分光光度计(UV-VIS mini1240);高速冷冻离心机(22331 hamburg);旋片式真空泵(ZXZ-1型)。

1.2 方法

1.2.1 破壁与厚垣孢子壁的提取称取1 g稻曲球厚垣孢子粉，然后采用本课题组的液氮研磨-超声波处理方法破壁［9］。破壁后离心(15000 r/ min，5 min)，弃上清液，再经真空干燥(－0.1 Pa，50℃)24 h，即得厚垣孢子壁提取物。

1.2.2 破壁率的测定普通光学显微镜(OLYMPUS)观察破壁前后厚垣孢子的形态并拍照，用血球计数板测定破壁前后完整的厚垣孢子数，计算破壁率。

a:破壁前每毫升样品中所含孢子数

b:破壁后每毫升样品中所含完整孢子数

1.2.3 黑色素的提取①酸提法:称取0.05 g的厚垣孢子壁提取物加入10 mL浓HCl，于水浴锅中水浴，然后用一定浓度的NaOH溶液提取，得到沉淀后再纯化和洗涤。最后离心(10000 r/ min)干燥(－0.1 Pa，50℃)得提取物。根据黑色素碱溶酸沉原理，酸提法采取以HCl为提取剂，考察提取过程中的影响因素:HCl浓度(A)，水浴120 min的温度(B)，NaOH(C);②碱提法:称取0.05 g厚垣孢子壁提取物，加入10 mL NaOH溶液水浴，然后用HCL沉淀，再用NaOH溶液提取，得到沉淀后纯化，洗涤，离心10000 r/min干燥得提取物(－0.1 Pa，50℃)。根据黑色素碱溶酸沉原理，酸提法采取以NaOH为提取剂，考察提取过程中的影响因素:HCl浓度(A)，水浴120 min的温度(B)，NaOH(C)。

1.2.4 黑色素含量测定①黑色素的标准曲线制作:取6支刻度试管，用NaOH溶液稀释黑色素标准品，按顺序加入下列溶液，即10 μg/mL的标准黑色素溶液，依次取用NaOH溶液稀释黑色素标准品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于比色杯中，不足1 mL的用蒸馏水补充到1 mL，再于各比色杯中加入4 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，用紫外分光光度计测定OD值，绘制黑色素标准曲线图，建立Y=aX+b回归方程(Y为OD值，X为黑色素含量，a为回归系数，b为常数);②样品黑色素含量测定:称取黑色素提取物0.001 g，加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，然后吸取1 mL溶液于最大吸收波长下比色(空白是0.1 mol/L NaOH加蒸馏水)，然后测定吸光值，根据回归方程计算出样品黑色素含量。

1.2.5 统计分析实验所得数据经DPS数据处理系统分析得出［10］。

表1 酸提法3因素3水平正交设计Table 1The orthogonal test of the 3 factors and 3 levels by HCl extraction

表2 碱提法3因素3水平正交设计Table 2The orthogonal test of the 3 factors and 3 levels by NaOH extraction

2 结果与分析

2.1 厚垣孢子破壁效果

用液氮研磨加超声波处理，用光学显微镜观察研磨后的厚垣孢子，再用血球计数板计算厚垣孢子的破壁率，破壁率在95%～98%，黄色厚垣孢子破壁率多达98%，黑色厚垣孢子破壁率为95%。

2.2 黑色素的紫外扫描光谱及标准曲线

用NaOH溶液稀释黑色素标准品，按黑色素标准曲线制作方法，经紫外分光光度计测定，其最大吸收波长为217 nm。依据OD与标准黑色素含量的关系，制作标准曲线，结果见图1。OD值与黑色素含量回归方程:Y=0.0522X+0.0069。

图1 黑色素含量的标准曲线Fig.1Standard curve of melanin content

2.32 种方法测定不同颜色厚垣孢子壁黑色素效果比较

2.3.1 酸提法从表3可知，2种类型孢子壁用酸提法的3因素极差R值表现为C＞B＞A，说明NaOH(C)浓度对提取2种颜色厚垣孢子壁黑色素含量的影响最大，其次是水浴温度，再次为HCl浓度。提取黑色素含量最佳的组合为1 mol/L HCl，80℃水浴120 min，1 mol/L NaOH。经方差分析，这3个因素对提取2种颜色厚垣孢子黑色素含量的影响差异不显著(P＞0.05)，相对而言C因素影响要大。

表3 酸提法测定2种不同颜色厚垣孢子壁黑色素含量Table 3Melanin content of 2 types of Chlamydospores wall by HCl extraction

表5 黄色厚垣孢子壁黑色素含量方差分析Table 5Variance analysis of melanin content in yellow chlamydospores wall

2.3.2 碱提法从表62种类型孢子壁用碱提法的3因素极差R值表现为A＞B＞C，说明NaOH作为提取剂其浓度对2种颜色厚垣孢子壁黑色素提取影响较大，其次是水浴温度，再次为HCl浓度。方差分析结果表明，A NaOH浓度，B水浴温度的P＜0.01，说明NaOH浓度、水浴温度对2种颜色厚垣孢子黑色素提取影响极显著，而C HCl浓度的0.01＜P＜0.05，说明HCl浓度对2种颜色厚垣孢子黑色素提取影响显著。

表6 碱提法测定2种不同颜色厚垣孢子壁黑色素含量Table 6Melanin content of 2 types of Chlamydospores wall by NaOH extraction

表7 黑色厚垣孢子壁黑色素含量方差分析Table 7Variance analysis of melanin content in black chlamydospores wall

表8 黄色厚垣孢子壁黑色素含量方差分析Table 8Variance analysis of melanin content in yellow chlamydospores wall

2.3.32 种提法的比较酸提法中，2种颜色厚垣孢子壁黑色素提取效果最佳的组合为A1B2C2;碱提法中，2种颜色厚垣孢子壁黑色素提取效果最佳的组合为A3B2C1。经方差分析，酸提法中各因素对厚垣孢子壁黑色素提取的效果影响不显著(P＞0.05)，而碱提法中因素C(HCl浓度)对厚垣孢子壁黑色素提取效果影响显著(P＜0.05)，而因素A(NaOH浓度)和因素B(水浴温度)对厚垣孢子壁黑色素提取效果影响极其显著(P＜0.01)。因此，比较2种提取方法，以碱提法为优，其最佳的组合条件为3 mol/L NaOH，2 mol/L HCl，水浴温度80℃，水浴时间120 min。

3 结论与讨论

本研究采用了酸提法和碱提法对稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素进行提取，黑色素的紫外最大吸收峰在217 nm处;在2种厚垣孢子壁黑色素提取法中，以碱提法提取为好，其最佳的组合条件为:3 mol/L NaOH，2 mol/L HCl，水浴温度80℃，水浴时间120 min。

吴尧等［8］用浓HCl从发酵培养的香灰菌菌丝中提取黑色素。张建萍等［11］利用黑色素碱溶酸沉的性质提取野生BC菌株的黑色素，但他们均不是仅从细胞壁中提取黑色素。曹志艳等［12］在沸水浴中用浓HCl提取玉米大斑病菌细胞壁黑色素，效果较好。在稻曲病菌厚垣孢子壁的黑色素提取方面，迄今国内外尚未有报道。因此，借鉴前人在其他真菌相关方面的研究，设计了酸提法和碱提法，并通过正交设计试验，得出以碱提法为佳，可能由于厚垣孢子壁厚、结构紧密，与真菌营养体菌丝差异较大，用碱提取法更为适宜［9］。本研究得出的碱提法提取稻曲病菌厚垣孢子壁黑色素简单易行，适合在实验室内操作。这将为进一步研究黑色素含量变化与厚垣孢子越冬休眠的关系提供有效的方法，亦可为其他类型真菌孢子黑色素的提取提供参考依据。

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Melanin Extraction from Chlamydospore Wall in Ustiloginoidea virens

MAO Ying，REN Zuo-hua，WANG Na，BAI Zhen-an，YU Xuan-jie，LIU Er-ming
(Coll.of Bio-Safety Sci.＆Technol.，Hunan Agric.Uni.，Changsha 410128)

HCl as an extractant for acid extraction and NaOH as an extractant for alkaline extraction were adopted to study the optimum extraction of melanin from chlamydospore wall in Ustilaginoidea virens，melanin extraction of black and yellow chlamydospore wall in U.virens and the experiment was carried out with orthogonal design using 3 factors and 3 levels.The result showed that using NaOH as the extractant was of optimal，and the optimal combination conditions was 3 mol/L NaOH，2 mol/L HCl in 80℃water bath for 120 min.

Ustiloginoidea virens;chlamydospore wall;melanin;extraction;orthogonal design

Q939.95

A

1005－7021(2011)01－0006－04

国家自然科学基金(30871615)

毛莹女，硕士研究生。研究生方向为微生物与植物分子互作。E-mail:spingice@qq.com

*通讯作者。Tel:0731-84618163，E-mail:emliu@126.com

2010-12-09;

2011-01-10