水稻稻曲病菌侵染行为的研究现状及展望

胡贤锋，王 健，李 明，李荣玉，3

(1.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州省山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

稻曲病(Rice false smut)是由稻曲病菌(有性态为Villosiclavavirens，无性态为Ustilaginoideavirens)侵染水稻小穗引起的穗部病害[1]。近年来，由于我国杂交水稻大面积推广和稻田肥水水平提高，稻曲病由历史上的次要病害演变为当前水稻生产上“新三大病害”之一[2]。此外，稻曲病不仅危害粮食产量，稻曲病菌产生稻曲菌素对动物微管蛋白组装和细胞有丝分裂具有较强抑制作用，严重影响稻米食用安全[3-4]。由于稻曲病研究起步晚，稻曲病菌在人工培养条件下菌丝生长十分缓慢，加之稻曲球为唯一可见病状，发病受气候条件影响大，且其侵染机制独特等制约了稻曲病深入研究，导致关于稻曲病的诸多理论问题不明晰，特别是侵染循环过程中初侵染源、侵染机制等存在争议[5-7]。研究人员在定量抗性位点分析等方面做了大量工作，但未鉴定出抗稻曲病菌水稻抗性基因[8-9]。因此，当前对稻曲病仍缺乏抗性较好的品种。鉴于此，从稻曲病菌的接种体系、初侵染源、侵染关键期、侵染位点、侵染过程、侵染机制等方面对国内外的研究进展进行综述，以期为进一步明确稻曲病菌致病机制，并为稻曲病抗性品种选育、防控药剂特异性靶标选择以及防控策略制定等提供理论参考。

1 水稻稻曲病发生与危害

稻曲病1878年在印度首次被报道，而在我国明朝就有“硬谷奴，谷穗霉者”的记载，实际就是对稻曲病的最初认识[10]。该病害在孟加拉国、日本、中国等40多个国家的水稻主产区普遍发生[11-14]。稻曲病在我国各稻区普遍发生，但每年发生严重程度差异较大，主要由于该病发生常受气候、品种及栽培等因素影响[15]。稻曲病产生稻曲球导致水稻收割时夹杂大量病粒，同时稻曲病菌劫持水稻营养物质形成稻曲球，致使秕谷增多，千粒质量下降，减产10%～50%[16]。稻曲病菌主要产生黑粉菌素和绿核菌素2类次生代谢产物[17]。现已在稻曲菌中分离鉴定了 26 种黑粉菌素：黑粉菌素 A、B、B1、C、D、E、E1、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W和3，4-二氢黑粉菌素T[18-19]。其中，黑粉菌素是一类可破坏真核生物有丝分裂的水溶性无色物质，对动植物细胞具有毒性，研究人员将稻曲球研磨成粉末拌饲料饲喂后，能够导致鸡、兔内脏器官病变[20-21]。

2 水稻稻曲病菌侵染行为

2.1 水稻稻曲病接种体系构建

当前，缺乏高效稳定引发稻曲病的人工接种技术仍是限制稻曲病深入研究的重要因子。迄今，多数研究者认为，在水稻破口前7 d，通过注射器将菌丝孢子混合液注入水稻穗苞并作保湿处理能够引发稻曲病。张君成等[22]通过人工接种稻曲病菌，发现液体培养获得薄壁分生孢子可引发稻曲病，分生孢子浓度越高，病穗率越高。其中，孢子菌丝混合液接种发病最严重，病穗率高达100%，最大病情指数为93.96%。LU等[23]的研究也表明，采用高速匀浆机将稻曲病菌菌丝和孢子打碎，制备菌丝孢子混合液，可引发稻曲病。因此，当前大多数研究人员采用稻曲病菌菌丝孢子混合液作为接种体。此外，JIA等[24]在室内控制条件下进行人工接种试验，比较不同幼穗分化期、温度、保湿时间等对发病率的影响，发现幼穗分化后期接种稻曲病菌发病率最高，同时，温度和湿度对稻曲病发病率影响较大，28 ℃条件下病穗率显著高于20 ℃。ASHIZAWA等[25]也报道，温度和湿度是引发稻曲病的重要因子，室内人工接种后16 ℃保持2 d，然后在100%湿度条件下保湿5 d，最有利于稻曲病发生。而胡东维等、WANG等[26-27]将白化菌株注射入水稻穗苞，其发病率显著高于喷雾接种，并且适当的低温刺激能够促进稻曲病的发生。在室内控温控湿条件下，用注射器将稻曲病菌分生孢子液注入水稻穗苞常具有较高发病率，但该方法并不能真正意义上模拟稻曲病菌田间自然侵染，难以解释田间稻曲病菌的真正侵染途径，不能真实反映水稻品种对稻曲病菌的抗性水平，因此，建立高效稳定的可模拟田间自然侵染的稻曲病菌人工接种体系，对研究其侵染途径及水稻抗性品种选育具有重要意义。

2.2 水稻稻曲病初侵染源

关于稻曲病菌的主要初侵染源尚存在争议。菌核在适宜条件下可萌发形成子座，子座产生子囊孢子，进而萌发产生分生孢子；厚垣孢子在适宜条件同样可产生分生孢子。菌核、厚垣孢子及种子带菌引发稻曲病均有报道[28-30]。有研究人员认为菌核是稻曲病菌主要的初侵染源：菌核越冬后在适宜的温湿度条件下萌发产生子囊孢子，子囊孢子萌发产生分生孢子侵染水稻花器官，厚垣孢子主要在稻曲病菌再侵染过程中起重要作用[31]。YONG等[32-33]研究发现，亚热带稻曲病菌可产生大量菌核，且单个稻曲菌便可产生大量子囊孢子，所以，即使仅有少量菌核萌发，也可产生大量初侵染源；此外，水稻抽穗时，利用孢子捕捉器可在温带和亚热带捕捉到子囊孢子。另有研究人员认为厚垣孢子才是主要的初侵染源，在我国河北等地很少发现菌核，且菌核在土壤中易溃烂[34]。IKEGAMI[35]用厚垣孢子接种水稻穗苞，能够导致水稻发病。姚琳等[36]将稻曲球分别置于4、-20 ℃条件下，8个月后检测其萌发率，4 ℃条件下保存的厚垣孢子萌发能力较强，可成为来年初侵染源。高必达等[37]认为田间越冬后的菌核和厚垣孢子是稻曲病的主要初侵染源，菌核和厚垣孢子萌发后产生子囊孢子和分生孢子，随雨水进行传播。刘见平等[38]则认为，种子带菌是稻曲病菌的主要初侵染源。总之，形成菌核或厚垣孢子是稻曲病菌越冬的重要方式，厚垣孢子和菌核在适宜的温湿度条件下均能形成分生孢子，侵染水稻花丝，最终形成稻曲球。因此，可通过调查越冬后田间菌核或厚垣孢子基数，或在侵染前期采用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增)等快速检测方法评估菌源数量，加强稻曲病的发生和危害预测预报。

2.3 水稻稻曲病侵染时期

明确稻曲病菌最佳侵染时期对确定其防控最佳时期具有指导意义。稻曲病的典型症状是在穗部形成稻曲球，故大多数研究人员认为，水稻孕穗期至破口期是稻曲病菌侵染的关键时期，但也有部分研究人员认为，稻曲病菌可能在水稻整个生育期潜伏。前人为了摸清稻曲病菌的最佳侵染时期做了大量研究工作。张震等[39]通过对稻曲球解剖，发现典型的稻曲球均可解剖出完整子房，由此推测稻曲病菌侵染水稻小穗发生在水稻开花之前，并直接从子房获得营养形成稻曲球。TANG等[2]也有相似报道，成熟稻曲球中含有6个完整花药，推测稻曲病菌主要侵染时期可能是在水稻花器官形成之后、水稻扬花之前。汪爱娟等[40]在稻株“叶枕平”(即水稻孕穗末期)用药具有较高防效，由此推测水稻孕穗期可能是稻曲病菌侵染的主要时期。李阳[41]用稻曲病菌在水稻芽期、三叶期、圆秆期和孕穗期进行接种试验，同时用稻曲病特异性PCR进行检测，发现自接种后每个发育时期均可检测到稻曲病菌的存在，推测稻曲病菌可寄生于水稻体内潜伏。陈永坚等[42]用厚垣孢子粗提液处理水稻苗期根系、苗期叶、芽鞘、种子，其病穗率分别为9.68%、2.58%、3.95%、2.04%，推测水稻整个生育期均可受到病原菌侵染。郭荣华等[43]在水稻生长几个关键时期用厚垣孢子悬浮液分期喷雾，发现处于破口初期的嫩颖最易遭到侵染，且田间药剂试验表明，在破口前7 d施药防效最高，推测稻曲菌可能的最佳侵染时期是在水稻破口前7 d。大量的人工接种试验表明，稻曲病菌在幼穗形成后即水稻穗苞破口前7 d为主要侵染时期，这已得到大多数研究人员认可。

2.4 水稻稻曲病侵染过程

为了探明稻曲病菌侵染水稻的过程，研究人员对稻曲病菌菌株进行标记与追踪，取得了新突破，发现稻曲病菌首先附着在水稻颖壳，进而侵染相应花器官。代光辉等[44]利用荧光显微镜对稻曲病菌分生孢子侵染途径进行观察，发现稻曲病菌分生孢子首先在颖口萌发产生菌丝，稻曲病菌菌丝沿颖口进入颖内。蔡洪生等[45]采用稻曲病菌孢子液对水稻进行人工接种后，发现菌丝最先在花丝和花药上出现，之后才出现在柱头上。郑大伟等[46]研究发现，稻曲病菌侵入水稻小穗后，首先出现在花药表面，后扩展至小穗基部。ASHIZAWA等[11]采用GFP(Green fluo-rescent protein,绿色荧光蛋白)标记菌株接种水稻穗部，实现了对稻曲病菌可视化追踪观察，发现稻曲病菌菌丝可通过水稻颖壳间隙入侵，随后稻曲病菌开始侵染水稻某些重要花器官。CHAO等[47]将稻曲病菌侵染分为3个阶段：稻曲病菌侵染雌蕊和柱头、扩展至雄蕊基部、包裹花器官后进入花药室产孢。雍明丽[48]研究发现，稻曲病菌易附着在幼根，在根系表皮细胞间隙可检测到稻曲病菌，但30 d后仍未发现稻曲病菌刺破厚壁组织层进入根的韧皮部，说明稻曲病菌很难通过附着在水稻根部进而达到穗部进行侵染。SONG等[49]研究发现，稻曲病菌的侵染过程是逐步的，稻曲病菌的侵染模式不同于经典的稻瘟病菌侵染模式(常以水稻叶片等作为侵染对象)，稻曲病菌通过颖壳间隙进入颖内后，首先攻击水稻花丝，阻止水稻花粉的成熟，同时阻断子房受精后劫持其营养库进而形成稻曲球，初步揭示了稻曲病菌的侵染过程。然而，稻曲病菌与花丝间的识别机制和形成稻曲球的营养物质来源尚不明晰，揭开稻曲病菌与花丝之间相互识别的生理生化机制、摸清稻曲病菌如何激发水稻相关灌浆基因的表达进而获取营养物质形成稻曲球可能是将来的研究方向。

2.5 稻曲病菌分子生物学

随着分子生物学技术的快速发展，稻曲病菌的侵染机制研究也得到长足进步。当前，已完成了稻曲病菌全基因组测序，并进行了致病相关基因的克隆与功能以及水稻响应稻曲病菌等相关研究。ZHANG等[50]对标准菌株Uv-8b进行测序，完成了标准菌株Uv-8b全基因组序列草图绘制，通过基因序列比对发现，稻曲病菌基因组中缺乏果胶分解酶基因，这可能与稻曲病菌独特的侵染方式有密切关系，从分子水平解释了稻曲病菌独特的侵染方式，并预测了193个富含半胱氨酸的蛋白质和628个分泌蛋白，以及与稻曲病菌次生代谢物质合成相关的重要因子。KUMAGAI等[51]对菌株IPU10进行全基因组测序，并预测了6 451个蛋白质。全基因组测序的完成为同源基因的克隆与功能研究带来极大便利。FAN等[12]在接种稻曲病菌后对水稻小穗进行转录组分析，发现调控水稻灌浆的基因RISBZ1和RPBF等被激活表达，而调控水稻开花的转录因子ARF8和ARF6等被抑制表达，且与水稻防御相关的相关基因NPRI和PRI出现下调表达，推测稻曲病菌能够激活灌浆基因的表达，从而获得大量营养物质形成稻曲球。研究人员通过比较稻曲病抗性品种IR28和感病品种黄华占接种后的转录组，在IR28和黄华占上分别找到1 405、1 066个差异表达的基因，这些差异表达的基因对过氧化物酶基因的差异性调控、次生代谢等起到重要调控作用[52]。当前，通过T-DNA随机插入的方法，获得了与稻曲病菌孢子形成和菌丝生长和致病性相关基因的插入突变体UvSpo76、Uvt-726、UvSUN2、UvT-B1464R和Uvt-1241，并通过定向敲除或RNAi的方法明确了UvHOG1、UvPRO1、Uvt3277和UvSLT2基因的功能。其中，UvSLT2基因主要产孢量与应激反应相关[53]，UvHOG1参与次级代谢[6]、菌丝生长和应激反应，UvPRO1和Uvt327参与孢子形成、菌丝生长，与致病性相关[7，54]。上述研究结果对于分离水稻抗稻曲病QTL(Quantitative trait locus,数量性状基因座)及选育水稻抗性品种具有重要意义。在以后研究工作中可针对稻曲病菌特异性侵染过程研究其功能基因，明确相关致病基因作用机制，也是快速摸清稻曲病菌致病机制的有效途径。

3 展望

稻曲病已成为我国水稻生产上严重影响稻米品质与产量的重要病害。关于稻曲病的研究起步较晚，且其发病受气候条件影响大，加之稻曲球为唯一可见病状，其侵染机制独特等因素制约，导致稻曲病相关研究尚不深入[26，55]。当前，人工注射接种是稻曲病菌接种试验中广泛运用的接种方法，但该方法不能解释田间稻曲病菌的真正侵染途径，难以反映水稻品种对稻曲病菌的真实抗性水平。田间稻曲病菌可通过形成菌核或厚垣孢子越冬后萌发产生分生孢子形成侵染源，在水稻穗苞破口前7 d从水稻颖壳间隙进入颖内，通过侵染花丝抑制水稻花粉的成熟，同时阻止子房受精后劫持其营养库进而形成稻曲球，初步揭示了稻曲病菌的侵染过程。与此同时，稻曲病菌全基因组测序已经完成，并进行了相关致病基因克隆与功能分析及水稻响应稻曲病菌等相关研究。明确了稻曲病菌侵染行为，对稻曲病抗性品种选育、防控药剂筛选以及防控策略制定具有重要意义。目前，对稻曲病的研究仍然有许多工作要做，以下几个方面可作为以后研究方向的参考。

(1)当前接种方法并不能真正意义上模拟稻曲病田间自然感病，故难以阐明田间自然发病真正的侵染途径。因此，建立高效稳定可真正模拟稻曲病菌自然感病的接种体系具有重要意义。

(2)稻曲病菌首先选择水稻花丝作为攻击目标，但稻曲病菌与花丝之间识别生理生化机制尚不明了，揭开稻曲病菌与花丝之间的相互识别机制，可为防控药剂开发靶标的选择和防控策略的制定提供依据。

(3)稻曲病菌能够产生大量的稻曲菌素，该毒素在稻曲病菌侵染过程中的作用鲜有报道，可研究其在稻曲病菌侵染水稻过程中的作用。

(4)稻曲病菌如何激发水稻相关灌浆基因的表达进而获取营养物质形成稻曲球可能是将来的研究方向。

(5)往往在产生稻曲球后才发现稻曲病已发生，常导致错过最佳的防控时期。因此，在侵染前期可使用LAMP等快速检测方法评估菌源数量，以加强稻曲病发生和危害的预测预报。