银杏叶片对衰老大鼠海马CREB表达影响的实验研究

王怀颖， 郝岩君， 张 悦， 辛海涛

自然衰老过程中人和啮齿类动物出现认知功能下降，老年大鼠表现许多与海马相关的空间记忆障碍。海马神经元信号转导分子水平变化可影响学习记忆。核转录因子 cAMP反应元件结合蛋白(CREB)连结多条信号转导途径，参与多种生理功能调节，是小鼠学习记忆形成的必须分子［1］，衰老及多种神经退行性疾病中可观察到CREB信号通路异常［2］。研究发现小鼠增龄过程中空间记忆功能改变与海马CREB磷酸化水平有关［3］。银杏叶片是从银杏科植物银杏树叶中提取的天然植物药，临床常用于脑血管病治疗，另外对衰老、痴呆、脑功能障碍也有一定改善作用，但确切机制尚不明确。本实验以自然衰老大鼠为研究对象，通过补充外源银杏叶片，观察其对老年大鼠空间记忆及海马CREB、pCREB表达影响，探讨可能的药理机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与试剂

清洁级雄性Wistar大鼠由河北省实验动物中心提供(合格证号804066)。试剂:CREB、p-CREB一抗、二抗，北京博奥森生物技术工程公司;β-actin一抗，Santa Cruz公司;化学发光试剂，河北博海生物工程公司。银杏叶片，广西金嗓子药业股份有限公司。蛋白测定试剂盒，碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 雄性Wistar大鼠分为青年对照组(3月龄)、老年对照组(13月龄)和银杏叶组(13月龄)。银杏叶组大鼠每日灌胃银杏叶片250mg/kg，其余两组动物每日灌胃等量蒸馏水，共8w。

1.2.2 Morris水迷宫实验 BI-2000水迷宫跟踪分析系统，由不锈钢圆形水池、一个可移动平台和摄像系统组成，成都泰盟科技有限公司提供。

(1)定向航行试验:测试大鼠学习能力。随机选择一个入水点，将大鼠背对平台放入水中，摄像机记录大鼠120s内找到平台时间，即逃避潜伏期。若大鼠找到平台，平台上停留15s。如果大鼠未在规定时间内找到平台，将其引导到平台，并停留15s，逃避潜伏期记为120s。每天上、下午各训练1次，共4d。

(2)空间搜索实验:考察大鼠记忆能力。第4天下午定向航行试验结束后，撤去平台，任选一个入水点将大鼠面朝池壁放入水中，记录120s内穿越原平台位置的次数及平台象限停留时间。

1.2.3 海马蛋白提取 行为学实验结束后腹腔注射10%水合氯醛麻醉动物，断头取脑，冰台上剥离海马，-70℃低温冰箱保存。取出低温冰箱保存的海马，加入适量组织裂解液于冰上研磨，4℃裂解30min，12000r/min离心 15min，取上清测定。BCA法测定组织匀浆液蛋白浓度。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品蛋白(每孔上样量30μg)，将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入 CREB、p-CREB、β-actin 一抗，4℃过夜，加入二抗室温孵育2h，加入ECL试剂反应，暗室发光，显影定影。Quantity one图像分析软件分析数据，以目的条带与β-actin吸光度比值进行半定量分析。

2 结果

2.1 定位航行试验

见图1。与青年对照组比较，老年对照组大鼠逃避潜伏期延长，具有显著性差异(P＜0.05)。银杏叶组大鼠逃避潜伏期比老年对照组缩短，差异显著(P＜0.05)。第1天与其余3d比较，逃避潜伏期最长(P＜0.05)。与第2天比较，第3天、第4天逃避潜伏期变短，有显著差异(P＜0.05)。第3天与第4天比较无显著性差异。

图1 不同组别大鼠逃避潜伏期

2.2 空间搜索试验

见表1。与青年对照组比较，老年对照组大鼠经过平台次数减少(P＜0.05)，平台象限停留时间缩短(P＜0.05)。银杏叶组大鼠经过平台次数多于老年对照组大鼠，平台象限停留时间比老年对照组大鼠延长，有显著性差异(P＜0.05)。

表1 大鼠空间搜索实验结果(±s)

表1 大鼠空间搜索实验结果(±s)

与年轻对照组比较*P＜0.05;△与老龄对照组比较P＜0.05

组别 动物只数 穿越平台次数 平台象限停留时间(s)年轻对照组老龄对照组银杏叶组10 10 10 9.6 ±2.875 6.8 ±2.486*9.4 ±2.633△41.554 ±6.296 34.919 ±4.557*40.996 ±6.683△

2.3 不同组别大鼠海马CREB、p-CREB表达

见图2。与青年对照组大鼠比较，老年对照组大鼠海马CREB表达明显下降(P＜0.05);银杏叶组大鼠海马CREB表达水平升高，与老年对照组相比差异显著(P＜0.05)。老年对照组大鼠海马p-CREB表达水平明显低于青年对照组(P＜0.05);与老年对照组比较，银杏叶片组大鼠海马p-CREB表达水平升高，有显著性差异(P＜0.05)。

图2 银杏叶片对衰老大鼠海马CREB、pCREB表达的影响

3 讨论

空间学习记忆功能是大鼠脑功能重要组成部分，老龄大鼠可表现与海马相关的空间记忆障碍。王蓉等以SD大鼠为研究对象，发现6月龄大鼠空间学习记忆能力最强，之后缓慢下降［4］。本实验利用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆功能，发现老年Wistar大鼠逃避潜伏期延长，平台象限停留时间缩短，穿越平台次数减少，与年轻对照组相比差异显著，说明老龄大鼠空间记忆功能降低。

CREB是一种组成型核转录因子，在各种激酶作用下，第133位Ser残基磷酸化而活化，与DNA序列cAMP反应元件CRE结合，促进下游基因转录。多种基因启动区包括CRE，如bcl-2、bdnf等，所以CREB信号转导途径下游表达产物参与调节细胞增殖与凋亡。当CREB作用被抑制后海马CA1区神经元数量减少，LTP受损，基因表达改变［5］。p-CREB被认为是大鼠海马空间记忆加工的分子标志物，大鼠空间学习过程中，cAMP-PKA-CERB信号传递途径被激活，海马p-CREB水平升高，促进空间记忆形成。增龄过程中，p-CREB水平降低导致小鼠空间记忆受损［3］。实验结果显示老年对照组大鼠海马CREB、p-CREB水平均低于年轻对照组大鼠，可能影响空间记忆功能。

增龄过程中细胞氧化防御系统功能下降，造成氧化应激，导致衰老和多种神经退行性疾病发生［6］。研究发现，抑制转基因小鼠CREB信号传递途径，造成死亡神经元增多，氧化应激产物增多，说明CREB信号传递途径可对抗氧化应激［7］。Ozqen等发现长期低水平H202刺激，造成心肌细胞CREB表达水平下降，影响该信号途径［8］。

银杏叶提取物主要成分是黄酮总甙和银杏萜内酯，能清除自由基，抑制细胞老化，对心、脑血管系统具有保护作用。小鼠补充EGb761后，可改善MPTP引起的神经退行症状［9］。实验中，服用银杏叶提取物后，老龄大鼠穿越平台次数和平台象限停留时间均延长，空间记忆改善。而且银杏叶组大鼠海马CREB表达和活性升高，说明银杏叶片可能通过上调大鼠海马CREB表达及活性，促进长时程增强改善老龄大鼠空间记忆功能。

［1］SekeresMJ，Never l，Frankland PW，etal.Dorsal hippocampal CREB is both necessary and sufficient for spatialmemory［J］.Learn Mem，2010，17(6):280-283.

［2］Salua CA，Valero J.The role of CREB signaling in Alzheimer’s disease and other cognitive disorders［J］.Rev Neurosci，2011，22(2):153-169.

［3］Porte Y，BuhotMC，Mons N.Alteration of CREB phosphorylation and spatialmemory defieits in aged 129T2/SV mice［J］.Aging，2008，29(10):1533-1546.

［4］王 蓉，唐 玉，叶翠飞，等.大鼠学习记忆功能随增龄变化的实验研究［J］.中国行为医学科学，2006，15(3):200-202.

［5］Janic D，Lopez de Armontia M，Valor LM，etal.Inhibition of cAMP response element-binding protein reduces neuronal excitability and plasticity，and triggers neurodegeneration［J］.Cereb Cortex，2009，19(11):2535-2547.

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［9］Rojas P，Serrano-Garcia N，Mares-Samano JJ，etal.EGb761 protects against nigrostriatal dopaminergic neurotoxicity in 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine-induced Parkinsonism inmice:role of oxidative stress［J］.Eur JNeurosci，2008，28(1):41-50.