活血化瘀方中黄芪不同剂量对抗氧化作用的影响

丁焦生

（焦作市第二人民医院 肾内科，河南 焦作454000）

肾脏是人体重要器官，许多实验研究已证实氧化应激在肾脏损伤中的重要作用。氧化应激作为一种致病介质参与各种原因导致的肾功能衰竭的发病过程［1］。因此抗氧化治疗可以明显减缓肾脏疾病并发症的发生和发展［2－3］。活血化瘀方剂具有活血通络、改善和调整血管内皮细胞功能障碍的作用。活血化瘀复方中大量使用黄芪已成为惯例。

黄芪又名黄耆、戴椹、独椹、蜀脂等，为豆科植物蒙左黄芪和膜夹黄芪的根，始载于《本经》［4］，列为上品。古人用其“主治肌表之水也，故能治黄汗、盗汗、皮水。又旁治身体肿或不仁者。”经芪芍桂枝苦酒汤、防己茯苓汤、黄芪桂枝五物汤等验证，其对“身体、四肢肿，水气在皮肤中，汗出恶风，汗沾衣，色正黄如蘖汁，身体不仁，暮盗汗，腰髋弛痛”［5］有较好疗效。但是盲目大量使用黄芪，也可导致较为明显副作用［6］。为充分开发、利用我国丰富的药用植物资源，本实验分析了自拟活血化瘀方剂中不同剂量黄芪组方对抗氧化作用的影响，以探讨黄芪适宜的使用剂量。

1 材料与方法

1.1 实验材料

益气活血方由黄芪、当归、丹参、白术、茯苓等组成，药物饮片均为广州康臣药业有限公司提供，黄芪按60g、30g、15g不同剂量分别与当归15g、丹参15g、白术12g、茯苓12g等配伍。加10倍水将药物浸泡1h，煮沸后再煎1.5h，纱布过滤；二煎加水8倍。煮沸后再煎1h，纱布过滤。两煎相合水浴浓缩，分别制得黄芪含量不同的A、B、C 3种药剂，使浓度用“g生药表达形式”为0.8g生药／mL，置于4℃冰箱保存备用。试验用胎牛肝、肾等组织取自广州增城奶牛场。其它试剂为国产分析纯。

1.2 仪器

Analyst AD酶标仪（美国 MD公司）；LDZ4－1.2低速离心机（北京精力离心机有限公司）；Sartorius BS224S／CB－25A电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；雷磁PHSJ－4A／JFP－8酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；DK2／CB253电热恒温震荡水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.3 药物及试剂的配置

药物浓度：0.8g生药／mL，组织浓度：100g／L匀浆，红细胞浓度：5%。

1.4 对牛肾自发性脂质过氧化的影响

新生小牛处死后，迅速取肾脏，装入冰盒带回实验室，在0℃～4℃下用生理盐水制成100g／L的组织匀浆。实验分为空白组：不给任何药物；模型对照组：单纯给予造模而不给药物；给药A、B、C的实验组：非别给予中药A药液、B药液、C药液；维生素E对照组。每组平行5管，每管加组织匀浆1mL，不同浓度药液0.2mL，混匀。37℃温育2h，按硫代巴比妥酸（TBA）法［7］测丙二醛（MDA）含量。结果见表1。

1.5 对H2O2诱导牛肾脂质过氧化的影响

同前法制备100g／L肾匀浆，分组同上。先在各管中加入100g／L肾匀浆1mL，各浓度药液0.2mL，37℃温育振荡反应15min，再向各管中加入100mmol／L H2O20.1mL，继续温育反应30min，各管加入200g／L三氯乙酸1.5mL终止反应，以10 000g离心10min，取上清液，加入P＝6.7g／L的TBA1.5mL，并于沸水中水浴15min，同上测定 MDA的含量。结果见表2。

1.6 对H2O2诱导红细胞氧化溶血的影响

取小牛全血，用肝素抗凝，用生理盐水（5min×2 000g）离心洗涤后，配成5%的红细胞悬液，分组同上，将红细胞悬液1.0mL加入各浓度给药组和对照组的试管中，对照组给予等量生理盐水，将试管37℃温育10min后，加50mmol／L H2O20.5mL继续温育1h，稀释5倍后离心（5min×2 000g），取上清液在530nm处测吸光值，以红细胞在对照组中的溶血率为100%，计算红细胞溶血率。结果见表3。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 对牛肾自发性脂质过氧化和H2O2诱导牛肾脂质过氧化的影响

实验结果显示，模型组MDA含量明显升高。与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.01）；A药组、B药组、C药组、维生素E组能明显降低MDA含量，与模型组比较均有显著性差异（P＜0.01）；A、C药组降低 MDA含量作用弱于B药组（表1、表2）。

表1 对牛肾自发性脂质过氧化各组MDA含量

表2 对H2O2诱导牛肾脂质过氧化物MDA的含量

2.2 对H2O2诱导红细胞氧化溶血的影响

实验结果显示，活血化瘀中药组方体外能显著抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血。A药组、B药组、C药组、维生素E组能明显抑制溶血，与模型组比较均有显著性差异，A、C药组作用弱于B药组（表3）。

表3 各组对H2O2诱导红细胞氧化溶血的影响

3 讨论

自由基化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。自由基因为带有单数电子，具有高度的氧化活性，它们极不稳定，活性极高，它们攻击细胞膜、线粒体膜，与膜中的不饱和脂肪酸反应，造成脂质过氧化增强。脂质过氧化产物又可分解为更多的自由基，如此一再重复，引起自由基的连锁反应。MDA和SOD、CAT、GSH－Px是目前公认的反应氧化应激水平的指标［8］。正常情况下，机体生理代谢过程中即可产生自由基，但体内也存在相应的自由基清除酶，如产生与清除间动态平衡，则不发生自由基连锁反应和组织损伤。但过剩会损伤细胞膜，使DNA断裂、蛋白质变性及酶失活，导致细胞解体和死亡。空气污染、日光、辐射、药物或不当饮食，也会使身体产生自由基。自由基氧化损伤血管内皮细胞、毛细血管基底膜和脑细胞，造成毛细血管通透性增高和细胞功能障碍。生成大量的脂质过氧化物，其中最主要的是MDA。MDA含量可反应其损伤程度。氧自由基是肝肾缺血性损伤的重要因素［9］。因此，寻找利于人体吸收的抗氧化剂及自由基清除剂，目前正成为人们关注的重点。

体外诱导脂质过氧化损伤模型为观察药物清除自由基提供了有效的手段。体外诱导试验中H2O2为反应提供了大量活性氧化剂，诱发多不饱和脂肪酸氧化，形成过氧化脂质或引起红细胞膜脂质氧化、膜蛋白发生聚集，导致红细胞溶血。MDA是脂质过氧化的主要产物，所以能够通过测定MDA和红细胞溶血程度可判断自由基的多少。本实验结果显示，模型组MDA含量明显升高，与历年的有关文献报道相一致；B药组及维生素E组MDA含量明显降低，与模型组比较，有显著性意义，30g黄芪配伍组具有较好的抗氧化、保护组织的作用。A药组也能使MDA含量降低，但作用不如30g黄芪配伍组。而15g黄芪配伍组抗氧化作用较弱。本实验结果提示在治疗肾脏疾病的活血化瘀复方配伍中，黄芪的用量宜大，其抗氧化效应明显强于小剂量，但随着其剂量的增大，抗氧化效应反而减弱。本实验结果证明在此活血化瘀方中黄芪用量以30g左右为宜，为黄芪在临床中的应用提供了证据。

［1］紫强.二氧化硫对小鼠肾脏的氧化损伤作用［J］.工业卫生与职业病，2004，30（1）：29.

［2］LEE H B.Reactive oxygen species as glucose signaling molecules in mesangial cells cultured under high glucose［J］.Kidney Int，2000，58（Suppl 77）：S19－25.

［3］Y，YANG Y，HA H，LEE G T，et al.Role of reactive oxygen species in TGF－betal－induced mitogen－activated protein kinase activation and epithelial mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16：667－675.

［4］《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海：上海科技出版社，1995：341－355.

［5］曹丙章.中国医学大成（十）［M］.北京：中国中医药出版社，1997：256－257.

［6］耿鉴庭.黄芪的临床应用与研究［J］.中西医结合杂志，1989，9（6）：327.

［7］陈奇编.中药药理研究方法学［M］.第1版.北京：人民卫生出版社，1993：941.

［8］ELENA ALANO，ALBERTO M，et al.Identification and characterization of human MT5－MMP，a new membranebound activator of progelatinase A over－expressed in brain tumors［J］.Cancer RES，1999：2570.

［9］HESS ML，MANSON NH.Molecular oxygen：Friend or foe.The role of the oxygen free radical system in the calcium paradox，the oxygen paradox and ischemia／reperfusion injury［J］.J Mol Cell Card／o／，1984，16（11）：969.