高效液相色谱法测定杠板归中槲皮素含量

杨佃志，戚秀萍

（山东医药技师学院，山东 泰安271000）

杠板归为蓼科植物杠板归（Polygonum perfoliatum（L.））的干燥地上部分。夏季开花时采割，本品为少数民族用药，味酸、苦，性平，归肺、小肠经，具有清热解毒、利湿消肿、散瘀止血的功效［1］。有文献报道了采用双波长薄层扫描测定杠扳归糖浆中槲皮素的含量方法［2］，为更有效地对其进行质量控制，本文建立了杠扳归药材中槲皮素的高效液相色谱测定方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Water 600高效液相色谱仪，600泵；Water 2487紫外检测器，威马龙色谱工作站；电子天平（上海精密科学仪器有限公司），ODS Dikma C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）。

1.2 材料

杠板归，经贵阳中医学院中药鉴定学教研室陈德媛教授鉴定为杠板归，药材60℃干燥30min，粉碎，过40目筛。槲皮素对照品（批号：100081－200406），购自中国药品生物制品检定所，纯度为97.3%；水为双重蒸馏水；甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。

2 色谱条件

流动相：MeOH－0.2%磷酸（55∶45），流速：1.0mL／min；检测波长360nm，柱温30℃，进样量为10μL，理论塔板数按槲皮素峰计算大于6 000。在此条件下，槲皮素峰的tR为14.7min，与相邻峰分离良好（R＞1.5）。

图1 杠板归药材HPLC色谱

3 方法学考察

3.1 对照品溶液的制备

精密称取经120℃干燥至恒重后，精密称取槲皮素对照品4.08mg，置于10mL量瓶，加甲醇9mL，超声溶解，冷却至室温后加甲醇定容至刻度，摇匀即得槲皮素对照品储备液（0.397mg／mL）。精密吸取储备液2mL，置10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，槲皮素对照品溶液（79.4μg／mL）。

3.2 样品溶液的制备

精密称取杠板归粗粉0.5g，置于50mL圆底烧瓶中，精密加入20%盐酸乙醇溶液25mL，水浴加热回流提取2h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失重量，0.45μm微孔膜过滤，即得。

3.3 线性范围关系考察

精密吸取储备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL，分别置于2mL量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，按上述色谱条件分别进样，测定峰面积。以槲皮素对照品溶液浓度为横坐标Y，峰面积积分值为坐标X，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y＝2.64X×10－5＋3.81，r＝0.999 1（n＝5），表明槲皮素在19.8～198μg／mL的浓度范围内呈良好线性关系。

3.4 重现性试验

连续进样6次，10μL／次，测定槲皮素标准品溶液的峰面积，RSD为1.22%。

3.5 精密度试验

分别精密吸取5μL对照品溶液，日内差试验在同日内测定，每个样品重复进样5次，RSD为2.40%（n＝5）；日间差试验在连续5日内测定，RSD为2.18%（n＝5）。通过对标准品日内及日间进样测定，结果表明精密度良好。

3.6 稳定性试验

按上述实验方法称取药材0.601 1g制备样品溶液，精密吸取10μL，每隔2h进样1次，共进样5次，RSD＝0.41，结果表明供试品溶液在8h内稳定性良好。

3.7 加样回收率试验

精密称取杠板归药材粗粉0.25g，取已知含量的供试液1.0mL6份，分别加入槲皮素标准溶液（2.420mg／mL）1mL混合均匀，测定含量，其平均回收率为100.37%，RSD为0.78%（n＝6）。结果见表1。

表1 槲皮素加样回收率 （n＝6）

3.8 样品含量测定

分别于贵阳万东桥药品交易市场购得贵州产杠板归药材3批，每批药材取3份样品，依上法测定含量，结果见表2。

4 结语

4.1 指标性成分的确定

由于国内外对杠板归尚未进行系统的化学成分研究，基础研究很不充分。杠板归中缺乏能够直接测定的有效成分或指标成分，或含量太低。本实验以槲皮索含量为指标成分，实验表明本方法快速、简便、准确，而且槲皮素本身具有祛痰、止咳、平喘作用，可作为杠板归的质量控制指标成分。

表2 杠板归药材含量测定

4.2 色谱条件的确定

4.2.1 检测波长的选择

取槲皮素对照品溶液，通过紫外扫描，溶液在254nm、360nm两个波长时有明显吸收。通过双波长色谱图分析，最后选择360nm作为测定波长，结果比较理想，峰形较好，干扰较少。

4.2.2 流动相的选择考察

本实验用甲醇与0.2%磷酸（体积比45∶55）可将槲皮素与其他峰分离，且流动相配比简单。在实验中曾考察了甲醇－0.2%磷酸不同比例（体积比55∶50、50∶50、45∶55）。结果表明，流动相比例除对保留时间有一定影响外，对槲皮素峰的分离和峰纯度无明显影响。

4.3 提取及水解条件的选择

杠板归药材中的槲皮素有一部分以苷元形式存在的，要将杠板归药材中的槲皮素提取出来，在实验中对提取溶剂、提取方法、提取时间、加酸量进行了考察。结果表明，确定采用20%盐酸的乙醇溶液加热回流提取2h时，提取率较高。

杠板归药材因特有的疗效而广泛应用于临床，但关于其质量评价方法的报道极少，本实验为杠板归药材及其制剂的质量控制提供了一种简便准确的分析方法，值得推广应用。

［1］贵州省中药材.民族药材质量标准［M］.贵州：贵州科技出版社，2003.

［2］谢辉，顾汉冲，许金宏.薄层扫描法测定杠板归糖浆中槲皮素的含量［J］.南京中医药大学学报，1997，13（2）：88.