冠状散囊菌基因组DNA提取方法比较研究

2011-09-18刘石泉赵运林胡治远雷存喜

茶叶 2011年4期

刘石泉赵运林胡治远雷存喜

(1.湖南农业大学生物科学与技术学院，湖南长沙 410128;2.湖南城市学院化学与环境工程系，湖南益阳 413000;3.黑茶研究所，湖南益阳 413000)

茯砖茶属于后发酵茶，是所有茶类中加工工艺最复杂、生产加工周期最长、工艺最独特的黑茶类产品。在茯砖茶制造中，选用黑毛茶为原料，通过筛分、汽蒸、握堆、称茶、蒸茶、压制、包装、发花、干燥、检验等工序制成［1］。其中发花是茯砖茶品质形成的关键工序。黑毛茶经渥堆、发酵及发花工艺产生金黄色的冠突散囊菌(Aspergillus Cristatus(Raper＆Fennell)Malloch＆Cain，该菌俗称金花)使茯砖茶内质金花普茂，独具菌花香，汤色红浓、香气纯正、滋味醇和。一直以来，茯砖茶是作为边疆少数名族日常生活中不可或缺的必备品，在边疆享有“宁可三日无粮，不可一日无茶”的美誉，其奥妙与茯砖茶的品质风味是不可分割的［2］。历来边疆少数民族通过判断金花质量和数量来衡量茯砖茶的品质优劣［3］，开发优质品牌茯砖茶，发展壮大茯砖茶产业、夯实品牌基础，显然离不开冠状散囊菌的分子生物学如DNA、蛋白质等研究。本研究旨在对茯砖茶中的优势菌种——冠状散囊菌进行DNA提取方法的比较研究，为后续冠状散囊菌的DNA分子标记技术，进行群体遗传研究打下基础。

随着分子生物学的发展，基因工程技术的广泛应用，通过提取DNA来用基因工程技术改善微生物的目的产量已成为许多科学工作者正在探索的热门课题，文献检索表明目前已有多种DNA的提取方法，但专门针对冠状散囊菌DNA的提取方法未检索到，我们认为很有必要参考真菌的 DNA提取方法［5－7］，对冠状散囊菌DNA的提取进行系统的比较研究。因为冠状散囊菌是真核细胞，拥有结构复杂的细胞壁，难以破坏，所以提取冠状散囊菌基因组DNA比提取大肠杆菌等细菌DNA要困难得多。本试验拟通过使用溶菌酶破壁法、纤维素酶破壁法、果胶酶破壁法、CTAB法、SDS法提取冠状散囊菌菌丝体和子囊孢子的基因组DNA，然后进行电泳检测、ITS序列的PCR扩增检测以及紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。期望在前人研究方法的基础上，摸索一套简便、易行的适于提取冠状散囊菌总DNA的方法，获得的总DNA含蛋白质少、降解不明显、产量较高、重复性好。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株从2007年益阳茶厂有限公司产金湘益特制礼品茯砖茶，采用PDA培养基培养，运用平板梯度稀释法分离获得的茯砖茶中的优势菌种——冠状散囊菌。

1.1.2 仪器高速台式冷冻离心机(Z36HK)、Bio-Rad DNA电泳仪、紫外可见分光光度计(TU-1810DASPC)、DNA扩增仪(TC-25/H)、凝胶成像分析系统(Gellabsystem)等。

1.1.3 主要试剂溶菌酶、纤维素酶、果胶酶、RNaseA等购置于上海生物工程有限公司;使用的真菌通用引物［8］ITS1(5'– TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') 和 ITS4(5'– TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')由上海生物工程有限公司合成;其他为国产分析纯试剂。

1.1.4 溶液配制 DNA缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10 mmol/L EDTA。

SDS 裂解液:2%Triton X-100、3%SDS(m/m)、0.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、50 mmol/L EDTA、2% β-巯基乙醇(v/v)用前加)。

CTAB 裂解液:100 mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)、20 mmol/L EDTA(pH 8.0)、1.4 mol/L NaCl。

0.1mol/L 磷酸钠缓冲液(pH 7.4):77.4 mL 0.1 mol/L Na2HPO4、22.6 mL 0.1 mol/L NaH2PO4。

山梨醇缓冲液:用0.1 mol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4)配制1.2 mol/L 山梨醇。

溶菌酶、纤维素酶、果胶酶缓冲液:用0.1 mol/L磷酸钠缓冲液分别配制成20 mg/mL酶液后用0.22 μm细菌滤膜过滤除菌。

PBS 缓冲液:0.01 mol/L Na2HPO4和 NaH2PO4(pH 7.0)、0.15 mol/L NaCl。

PDA液体培养基:将马铃薯洗净去皮，称取200 g，切成小块放入烧杯中，加适量蒸馏水，煮沸1小时，稍冷后用双层纱布过滤，加入蔗糖20 g，混匀，用量筒定容至1000 mL，趁热分装在三角瓶中，在1.1 kg/cm2(121℃)中保持20分钟灭菌(固体培养基在灭菌前加1%的琼脂)。

1.2 冠状散囊菌基因组DNA提取方法

1.2.1 溶菌酶破壁法冠状散囊菌接种于50 mL PDA液体培养基中，28℃、280 rpm震荡培养培养96h，用无菌纱布过滤分开子囊孢子和菌丝体，室温下10 000 rpm离心5 min收集子囊孢子，自然干燥后分别准确称取0.1 g子囊孢子和菌丝体，分别用PBS缓冲液1.5 mL重悬子囊孢子和菌丝体，室温下10 000 rpm离心5 min收集子囊孢子和菌丝体;用山梨醇溶液100μL重悬，加入5μL 20 mg/mL溶菌酶37℃温浴过夜(12h);液氮速冻，然后65℃水浴中溶解，反复3次;向悬浮液中加入150μL 5 mol/L KAc(pH8.9)轻轻混匀，然后12 000 rpm离心10 min;将上清转移到新的1.5 mL离心管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒数次，然后12 000 r/min离心10 min;重复抽提一次;转移上清到新的1.5 mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠溶液，轻轻混匀，－20℃ 放置30 min后12 000 rpm离心10min;除去上清，将沉淀溶解在100μL DNA缓冲液中，加入6 μL RNaseA(10 mg/mL)，37℃温浴30 min，加入1/2 体积的7.5 mol/L NH4Ac(pH7.5)和等体积的异丙醇，－20℃放置30 min后12 000 r/min离心10 min;除去上清，加入500μL 70%乙醇漂洗沉淀2次，12 000 r/min离心5 min;风干除去乙醇，用50 μL ddH2O溶解冠状散囊菌DNA，－20℃保存备用。

1.2.2 纤维素酶破壁法操作同1.2.1，其中20 mg/mL溶菌酶换成含20 mg/mL纤维素酶溶液。

1.2.3 果胶酶破壁法操作同1.2.1，其中20 mg/mL溶菌酶换成含20 mg/mL果胶酶溶液。

1.2.4 CTAB法冠状散囊菌的重悬子囊孢子和菌丝体液制备方法同1.2.1，分别取1.5 mL子囊孢子和菌丝体重悬液，室温下10 000 r/min离心5 min收集孢子和菌丝体;分别用液氮碾磨破壁。加250 μL CTAB 裂解液混匀，65℃保温1 h。10 000 r/min离心10 min。取上清，将上清转移到新的1.5 mL离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻颠倒数次，然后12 000 r/min离心10 min;重复抽提一次;然后转移上清到新的1.5 mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠溶液，轻轻混匀，－20℃放置30 min后12 000 rpm离心10 min;除去上清，将沉淀溶解在100μL DNA 缓冲液中，加入 6 μL RNaseA(10 mg/mL)，37℃温浴30 min，加入1/2 体积的 7.5 mol/L NH4Ac(pH 7.5)和等体积的异丙醇，－20℃放置30 min后12 000 r/min离心10min;除去上清，加入500 μL 70%乙醇漂洗沉淀2次，12 000 r/min离心5 min;风干除去乙醇，用50μLddH2O溶解冠状散囊菌DNA，－20℃保存备用。

1.2.5 SDS法将250 μL CTAB裂解液换成加250 μL SDS 裂解液，其他操作同1.2.4。

1.3 冠状散囊菌基因组DNA质量检测

1.3.1 凝胶电泳检测基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，点样2 μL，80 V恒定电压40 min，然后用凝胶成像分析系统(Gellabsystem)拍照。

1.3.2 纯度及浓度检测样品稀释100倍，终体积500 μL，做3个平行对照，混匀后用紫外可见分光光度计(TU-1810DASPC)测定，分析各种方法所提冠状散囊菌基因组DNA纯度及浓度。A260值代表其浓度，一般OD260/OD280＜1.7，表明样品中蛋白质含量过多;OD260/OD280＞2.0，表明 RNA含量过多;OD260/OD280为1.8表示纯度好。

1.3.3 ITS的PCR检测使用50 μL反应体系为:10 × buffer(5 μL)、25 mM DNTP(1 μL)10 μM ITS1(3 μL) 、10 μM ITS4(3 μL)、DNA 模板(2 μL)、5 U/μL TaqE(0.2 μL)、DDH2O(35.8 μL);使用的PCR 程序为:94℃预变10 min，94℃ 45 s、55℃ 60 s、72℃ 2 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，点样2 μL，80 V 恒定电压 40 min，然后用凝胶成像分析系统(Gellabsystem)拍照。

2 结果与讨论

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测冠状散囊菌基因组DNA

从电泳结果(图1)可以看出，各种方法所提冠状散囊菌基因组DNA分子大小基本一致，说明五种方法均能提取该菌株基因组DNA;十条条带的亮度都是冠状散囊菌菌丝体作提取材料的要亮，说明用冠状散囊菌菌丝体作为材料提取的DNA的收获量明显优于用子囊孢子;用溶菌酶、纤维素酶、果胶酶提取DNA从琼脂糖凝胶电泳检测条带上很难发现有明显差异说明其破壁能力相差不大;用CTAB法提取该菌株基因组DNA琼脂糖凝胶电泳条带亮度最弱，说明该法说明DNA的收获率较低，而用SDS法提取该电泳条带亮度最亮，说明该法说明DNA的收获率最高，是较为理想的DNA提取方法。

2.2 冠状散囊菌基因组DNA的浓度、纯度比较

用分光光度计测定出了各种方法提取的冠状散囊菌基因组DNA的浓度，通过紫外可见分光光度计(TU-1810DASPC)测定各个DNA的纯度和浓度如表1所示，其中溶菌酶破壁法、纤维素酶破壁法、果胶酶破壁法三种酶破壁法，均以菌丝体基因组DNA的得率较高，其中最高的是溶菌酶，达到了1.57 mg/mL。CTAB法和SDS法同样以菌丝体基因组DNA的得率较高，SDS法在所有方法中基因组DNA的得率最高，其中以菌丝体为材料的DNA得率达到了最高1.69 mg/mL。5种方法所提取的DNA都在OD260处有显著吸收峰。用子囊孢子为材料提取的基因组 DNA，其 OD260/OD280比值都接近1.8，说明它们的纯度都较高，去蛋白和去RNA的效果都较好;用菌丝体为材料提取的基因组DNA，其OD260/OD280比值都小于1.8，且比用子囊孢子的对应方法都要小，说明有菌丝体作为提取基因组DNA的材料，含有一定残留的蛋白质的量较用子囊孢子的要高。其OD260/OD280比值除纤维素酶法外没有明显大于1.8的，说明去RNA的效果都较好。为了不影响后续试验，本研究没有使用TE缓冲液溶解DNA，而使用了ddH2O。若用TE缓冲液溶解DNA，由于pH值和离子存在会稍微影响光吸收值，其OD260/OD280比值会稍高，更接近标准值 1.8［9］。

表1 DNA五种不同提取方法纯度和浓度检测结果Table 1 The concentration and purity of Eurotium cristatum DNAs extracted by five methods

2.3 冠状散囊菌基因组DNA的ITS序列PCR检测结果

使用真菌通用引物ITS 1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')和ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')进行PCR扩增，从凝胶电泳结果(图2)可以看出，各种方法所提冠状散囊菌基因组DNA均能扩增出长度为560bp的目的条带，说明五种方法均能较为完整的提取冠状散囊菌基因组DNA。

3 讨论

文献检索表明，溶菌酶破壁法、纤维素酶破壁法、果胶酶破壁法、CTAB法、SDS法均有提取真菌基因组的较为成功的先例，只是未应用在冠状散囊菌中进行研究，更未进行系统的比较研究，本实验不但进行了这5种方法的比较，而且对5种方法分别用冠状散囊菌菌丝体和子囊孢子作为材料，对比了其提取基因组DNA的效果，实验结果说明能筛选出较为切实可行的提取方法。

溶菌酶在食品工业、医学和酶工程中应用十分广泛［10］。在DNA的提取中主要应用在细菌中进行辅助破壁，如金黄色葡萄球［11］、白色瘤胃球菌［12］等。其中三种酶法提取DNA中，溶菌酶破壁法效果较好，其DNA收获量较其他酶法也稍高，我们认为这主要与溶菌酶的作用及特点有关，溶菌酶以溶解革兰氏阴性细菌的细胞壁而具有溶菌作用，原因在于它能水解N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1.4糖苷键。溶菌酶发挥溶菌作用的最适酸度在 pH 8.0 左右，溶菌酶在 pH 1.2 ～11.3 的广泛范围内剧烈变化时都没有发现溶菌酶活性任何改变，因此溶菌酶对酸碱度的变化不敏感。在碱性范围时，稳定性较差。溶菌酶的热变性是可逆的，其变性温度一般不高于70℃，溶菌酶是相当稳定的［13］。但冠状散囊菌是真菌，其细胞壁结构与革兰氏阴性细菌显著不同，从试验结果看，其DNA收获量远较SDS法的低，很可能是溶菌酶裂解法不能使真菌细胞壁裂解充分，基因组DNA释放不充分，同时也导致去除蛋白质及苯酚不彻底。

纤维素酶由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。习惯上，将纤维素酶分成三类:C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖［14，15］。其纤维素酶对底物的最适作用温度为45℃，最适 pH 值为 4.5 － 5.0［16］。纤维素酶在环境、药品、食品、饲料、酿酒、洗涤剂工业和石油开采等方面都有很好的应用［16］，纤维素酶预处理能明显提高植物的破壁效果［17，18］。

果胶酶是分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶;果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸;果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。但作用pH 2.5－6.0较为窄，且最适作用pH 3.5，作用温度为15～55℃左右。最适作用温度为50℃。目前果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域得到广泛应用［19］。

我们用上述溶菌酶、纤维素酶、果胶酶三种酶都能有效提取真菌DNA，且其提取效果有一定的差异，但差异不大，我们认为这三种酶各自的优化作用条件应该有差异，但我们统一用一种条件进行裂解，显然不能说明三种酶的作用全貌，相对来讲溶菌酶的稍好，可能是该酶的适应pH值相对较广，而纤维素酶、果胶酶属于酸性适应裂解酶。

CTAB法主要用于植物DNA的提取［20］以真菌菌丝体为材料的DNA提取也有一些成功报道［21－24］，但提取质量亟待改善，主要原因是真菌多糖、多酚等次生物质的存在使提取的真菌DNA中总残留多糖杂质，由于其许多理化性质与核酸很相似，因此很难将它们分开。多糖的污染，不仅使DNA定量不准，还直接影响下游反应酶的活性［25］。正因此很多学者在运用该法时往往加以改进，如杨同文等［26］采用CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒提取食用菌DNA来除去杂质污染。我们的实验证明CTAB法提取冠状散囊菌基因组DNA在五种方法中效果确实是最差的，说明其提取方法还有待优化和改进。

SDS法广泛用于植物、动物、微生物的DNA提取［27－29］，其中特别是对多糖含量丰富的植物效果尤为明显，如李静等对石斛基因组DNA研究［30］，本研究证实对冠状散囊菌基因组DNA提取效果是最好的，不但DNA收获率较高，而且其紫外可见分光光度计(TU-1810DASPC)DNA的纯度检测也证实其纯度较其他方法的好。

本实验中，所用的材料冠状散囊菌菌丝体和子囊孢子，五种方法在提取DNA时也表现出一定的差异，但都证实用冠状散囊菌菌丝体作为DNA提取材料优于用子囊孢子。具体体现在DNA的收获量、纯度上(见表1)，笔者认为，导致该差异出现的主要原因是冠状散囊菌菌丝体细胞壁和子囊孢子子囊壁的结构不同导致，冠状散囊菌菌丝体提取效果普遍优于对应的子囊孢子，说明菌丝体结构上更容易破壁而释放基因组DNA。另外DNA的存在环境致使细胞多糖、多酚等非DNA组分影响其DNA提取也是不可忽视的一个重要因素，很显然，相关的研究尚需进一步的深入。

综合以上实验结果，结合成本因素我们建议用冠状散囊菌菌丝体作为材料，采用SDS法进行基因组DNA提取，能稳定获得含蛋白质少、降解不明显、产量较高的基因组DNA。

1 金冬双，龚淑英.黑茶的微生物作用研究进展.茶叶，2007，33(4):203－207.

2 王融初，彭雄根.茯茶生产科技发展与西北民族情缘.茶叶通讯，2007，34(1):44－47.

3 刘作易，秦京.“金花”菌与茯砖茶品质.贵州农院学报，1991，10(1):79－82.

4 Nathalie F，Danielle B，Kenneth L，et al.Soil washing improves the recovery of total community DNA from polluted and high organic content sediments.Journal of Microbiological Methods，2004，56:181－191.

5 Karen L M，Robert H F.Convenient deteration of DNA extraction efficiency using an external DNA recovery standard and quantitativecompetitive PCR.Journal of Microbiological Methods，2004，57:259－268.

6 Linda W C，Robin K，Patricia L，et al.Evaluation of DNA extraction methods for the detection of mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis by polymerase chain reaction Diagnostic.Microbiology and Infectious Disease，2004，48(1):39－45.

7 Lee Y K，Kim H W，Liu C L，et al.A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.Journal of Microbiological Methods，2003，52:245 －250.

8 Chen Y C，Eisner J D，Kattar M M，et al.Polymorphic internal transcribed spacerregion 1 DNA sequencesidentifymedically important yeasts.Journal of Clinical Microbiology，2001，39(11):4042－4051.

9 张文玲.转基因产品定性PCR检测的技术要点.种子，2009，28(2):109－110.

10 陈艳，江明锋，叶煜辉.溶菌酶的研究进展.生物学杂志，2009，26(2):64－66.

11 谈小云，陈小英，陈知本.用溶菌酶-SDS微量法提取金黄色葡萄球菌质粒DNA.中国药科大学学报，1987，18(1):36－39.

12 程超，郝永清，张林冲.白色瘤胃球菌DNA提取的优化试验.饲料工业，2009，30(2):29－30.

13 陈艳，江明锋，叶煜辉.溶菌酶的研究进展.生物学杂志，2009，26(2):64－66.

14 谢敬.纤维素酶的研究进展.化学工业与工程技术，2010，31(5):46－49.

15 刘晓晶，李田，翟增强.纤维素酶的研究现状及应用前景.安徽农业科学，2011，39(4):1920－1921，1924.

16 楚杰，李树品.纤维素酶高活性菌株的选育及酶最适作用条件的研究.山东科学，1998，11(2):51－54.

17 万日余，顾岱芳.纤维素酶在草莓汁生产中的应用.冷冻与速冻食品工业，1996(4):20－21.

18 陈颖，刘根齐，李文彬.3种小球藻DNA提取方法的比较.植物生理学通讯，2010，37(3):242－244.

19 李祖明，张洪勋，白志辉.微生物果胶酶研究进展.生物技术通报，2010，3:42－48.

20 陈昆松，李方，徐昌杰.改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取.遗传，2004，26(4):529－531.