利用响应面法优化茶叶中EGC的浸提条件

2011-09-18王贤波崔红春黄海涛

茶叶 2011年4期

王贤波崔红春黄海涛

(杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024)

茶叶中儿茶素(catechin)是茶叶中重要的一类天然活性物质，是天然的抗氧化剂和自由基清除剂，被广泛的应用于食品加工、医药保健等领域［1，2，3］。儿茶素占茶叶中茶多酚总量的60% ～80%，主要有表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)及表儿茶素(EC)等［3，4］。大量实验已证明儿茶素具有抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基、压制黑色素合成等作用［2］。有研究表明 EGC的抗氧化能力仅次于EGCG［5］。因此，EGC 的提取制备研究具有重要意义。

响应面方法(Response Surface Methodology，RSM)是20世纪中后叶发展起来的优化试验条件统计学方法［6］，利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，它可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，它已成为精度高、应用广并具有实用价值的优化技术［7］，因此被广泛地应用于条件优化和模型建立中。

本文用去离子水浸提茶叶中的EGC，在单因素实验的基础上，利用响应面法对EGC的浸提条件进行优化，得到最佳浸提条件，为后期提纯提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

茶叶:采自余杭径山茶园。

1.2 主要仪器和试剂

高效液相色谱仪(美国Waters公司)，电子天平(METTLER公司)，数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

甲酸、乙腈为色谱纯，EGC标准品(Sigma公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 茶叶中EGC浸提茶叶过20目筛，用去离子水浸提，称取50 g绿茶粉末于烧杯中，加入一定量去离子水，在恒温水浴锅中于一定温度下浸提一定时间后，过滤，得茶多酚浸提液，用高效液相色谱法检测EGC含量。

1.3.2 EGC浸出率的测定取 EGC标准样用HPLC法测定浓度－峰面积标准线性方程如下:

式中，Y为峰面积(μV·S);X为EGC的质量浓度 (mg/L);方程的线性相关系数为0.9998679;色谱条件:以0.5%的甲酸和乙腈为流动相梯度洗脱，检测波长为280 nm，流速为1 mL/min。

EGC浸出率由下式计算:

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

取50 g绿茶粉末于烧杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去离子水，浸提1次，pH 6.0，在恒温水浴锅中于80℃下浸提不同时间，过滤，得茶多酚浸提液，用高效液相色谱法检测EGC含量，计算EGC浸出率，结果见图1。

图1 浸提时间对EGC浸出率的影响

取50 g绿茶粉末于烧杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去离子水，浸提1次，pH 6.0，在不同温度下浸提20 min，过滤，得茶多酚浸提液，用高效液相色谱法检测EGC含量，计算EGC浸出率，结果见图2。

取50 g绿茶粉末于烧杯中，浸提1次，pH 6.0，在80℃下浸提20 min，按照不同料液比进行浸提，过滤，得茶多酚浸提液，用高效液相色谱法检测EGC含量，计算EGC浸出率，结果见图3。

取50 g绿茶粉末于烧杯中，按照1∶12料液比，浸提1次，在80℃下浸提20 min，在不同pH值下浸提，过滤，得茶多酚浸提液，用高效液相色谱法检测EGC含量，计算EGC浸出率，结果见图4。

图4 浸提pH对EGC浸出率的影响

取50 g绿茶粉末于烧杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去离子水，pH 6.0，在80℃下浸提20 min，浸提不同次数，过滤，得茶多酚浸提液，用高效液相色谱法检测EGC含量，计算EGC浸出率，结果见图5。

由图1可知，在20分钟时EGC浸出率最大，之后逐渐下降，可能是随着时间的延长，EGC发生了异构反应。由图2可知，随着温度升高，EGC浸出率先升高后降低，这可能是因为随着温度的升高EGC变得不稳定，发生了异构反应。由图3可知，随着料液比的增加，EGC浸出率随之增加，但是1∶12之后变化不明显，而且随着溶剂的增加会给后续处理带来麻烦，所以料液比不宜过大，本实验选择料液比为1∶12。由图4可知，EGC的浸出率随着pH值的升高先变大后降低，在酸性环境中可能是没食子基团在起作用，容易与酸结合，导致游离的EGC减少［8］，pH值升高可能引起EGC氧化。由图5可知，EGC浸出率随着次数的增加而增加，但从浸提2次以后浸出率的变化不明显。

图5 浸提次数对EGC浸出率的影响

2.2 响应面法优化EGC的浸提条件

根据单因素实验结果，在选定料液比为1∶12，浸提2次的前提下，采用Box-Benhnken实验设计进行三因素三水平的响应面分析实验，包括12个析因实验和3个中心实验。以浸提温度，浸提时间，pH为自变量，以EGC浸出率为响应值，实验因素与水平的选取见表1，响应面实验的结果见表2。

表1 因素与水平取值表

表2 Box-Behnken响应面实验设计及实验结果

利用统计软件MINITAB15对实验数据进行二次多项回归拟合，然后对回归方程进行方差分析，结果见表3。

利用MINITAB15回归拟合实验数据，获得EGC浸出率对浸提温度，浸提时间，pH的三元二次回归方程:Y=1.93333 －0.06A －0.0425B+0.0625C －0.15917A2－ 0.11417B2－ 0.19417C2－ 0.01AB －0.02AC+0.025BC。由回归方程的方差分析结果(表3)可以看出，该模型失拟不显著，回归显著。另外该模型决定系数R2=0.9761，说明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性，因此该模型可以应用于EGC浸出率的理论预测。EGC浸出率响应面分析关键点值见表4。

表3 回归方程的方差分析

表4 EGC浸出率响应面分析关键点值

由表4可知，该回归模型存在稳定点，EGC浸出率的最大估计值1.9475%，3个因素取值分别为:浸提温度78.0808℃、时间18.4848 min、pH 6.1515。结合单因素实验结果，为计算方便各因素取整数得到 EGC 浸提优化条件:料液比 1∶12、pH 6.2、温度78℃、时间 18 min、浸提 2次。图 6－8为通过MINITAB15得到的响应面分析图及其等高线图，每个响应面分别代表着两个独立变量之间的相互作用，由响应面图可以看出:浸提温度、浸提时间、pH与EGC浸出率存在相关性。利用得到的优化条件进行浸提验证，得到EGC浸出率为2.0%，说明该模型可以应用于EGC浸出率的预测。