尿毒清颗粒对单侧输尿管梗阻肾间质纤维化大鼠肾脏Toll样受体4表达的影响

胡志娟，贾晓梅，史亚男，郭 岚，董春霞，刘 冰，牛 凯

近年来Toll样受体 (toll like receptor，TLR)在肾脏疾病发病机制中的作用日益受到关注［1］。其中TLR4是由内毒素所编码的Ⅰ型跨膜受体，主要在内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞及中性粒细胞上表达［2］。在进行性肾脏纤维化过程中，由于基质增加，使巨噬细胞上TLR4的内源性配体暴露增多，如热休克蛋白60、纤维蛋白原、硫酸类肝素、纤维连接蛋白的EDA、透明质酸等。内源性配体能够激活TLR4，活化的TLR4及相关配体诱导核因子κB激活，启动白介素－1、白介素－6、白介素 －8、白介素 －12、肿瘤坏死因子 －α及 CD80与CD86等基因的转录，介导各种病原体的识别和免疫活化过程，从而导致肾脏损伤［1］。本研究采用大鼠单侧输尿管梗阻 (unilateral ureteral obstruction，UUO)诱导的肾间质纤维化 (RIF)模型，观察该模型TLR4的表达，探讨TLR4在RIF过程的作用，以及药物对UUO大鼠肾功能的影响和作用机制，为RIF的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 健康雄性SD大鼠24只 (由河北医科大学动物室提供)，体质量150～180 g，随机分成4组，各6只:(1)正常对照组; (2)假手术组; (3)手术组;(4)尿毒清组。手术组和尿毒清组大鼠用硫喷妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，大鼠腹部正中偏左纵切口2 cm打开腹腔，暴露左肾，钝性分离左输尿管，于靠近肾盂段处行左输尿管结扎后缝合腹腔;假手术组打开大鼠腹腔后仅分离左输尿管，不结扎。模型建立后第2天起，每日8:00尿毒清组用尿毒清颗粒 (广州康臣生产)50 mg/kg灌胃 (溶于注射用水);其余组给予等量注射用水灌胃。术后14 d处死大鼠。

1.2 观察指标及检测方法 大鼠处死时以3%水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，心脏取血标本约3 ml。血肌酐 (SCr)、尿素氮 (BUN)的测定在Beckman全自动生化分析仪上完成。黄嘌呤氧化酶法测定左肾组织的总超氧化物歧化酶 (TSOD)活力、硫代巴比妥酸 (TBA)法测定左肾组织的丙二醛(MDA)水平。试剂盒为上海朗顿生产。

1.3 转化生长因子－β1(transforming growth factor－β1，TGF－β1)的反转录聚合酶链反应 (RT－PCR)分析 均采用TRIzol(Invitrogen公司)试剂一步抽提总RNA，再反转录成cDNA(反转录酶AMV－RT购自美国Promega公司)。以适量cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶 (Promega公司)催化下行PCR，引物由上海生物工程公司合成。actin:正链5'1－GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA－3'1，负链5'1－GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG－3'1。扩增条件为95℃5 min，然后95℃45 s，55℃45 s，72℃45 s(35个循环)，72℃延伸5 min。扩增目的片段长度为375 bp;TGF－β1:正链5'1－CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C－3'1，负链5'1－CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C－3'1。扩增条件为94℃2 min，然后94℃30 s，65℃30 s，72℃30 s(27个循环)，72℃延伸5 min。扩增目的片段长度为298 bp;PCR产物经2% 琼脂糖凝胶电泳 (含0.5 μg/ml溴乙啶)，再用UVP凝胶图像成像系统进行分析，以待检测指标与actin吸光度的比值来表示其相对含量 (目的基因相对表达量=目的基因条带吸光度/actin基因条带吸光度)。

1.4 肾组织病理及免疫组织化学法检测TLR4蛋白的表达经4%的多聚甲醛固定的肾组织石蜡包埋，制成3 μm厚的切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化行HE染色。采用Evision试剂盒进行免疫组化染色:每张切片滴加山羊血清，室温下孵育30 min以封闭内源性抗原;倾倒不洗，每张切片加50 μl的第一抗体，4℃孵育过夜;PBS冲洗，每张切片加50 μl第二抗体，室温孵育30 min;PBS冲洗，DAB显色;自来水冲洗，苏木精复染，PBS冲洗返蓝，自来水冲洗，梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封固。采用彩色病理图像分析系统 (北京航空航天大学)，通过光学显微镜 (×200)摄取图像，输入图像分析系统内，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。对每例切片随机选取20个不重叠视野，计算阳性面积和整个视野面积的比值 (去除肾血管、肾小球及肾小管管腔所占面积) ，取其平均值进行比较。

1.5 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件进行分析。计量资料用±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 (

2 结果

2.1 一般情况 肉眼观察，假手术组肾脏大小形态正常，颜色暗红;手术组梗阻侧肾脏肿大，颜色变浅，有囊性感，内含褐色混浊尿液，肾实质变薄，尿毒清组介于二者之间。

2.2 观察指标水平的比较 4组大鼠BUN、SCr、T－SOD、MDA水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.01)。其中，假手术组与手术组的BUN、SCr、T－SOD、MDA水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05)。尿毒清组与手术组大鼠的BUN、SCr、T－SOD、MDA水平比较，差异均有统计学意义(P＜0.05，见表1)。

2.3 TGF－β1mRNA的表达 4组大鼠TGF－β1mRNA的表达水平比较，差异有统计学意义 (P＜0.01)。其中，假手术组与手术组、手术组与尿毒清组的TGF－β1mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表2，图1)。

2.4 肾脏病理改变 光镜下可见 (HE染色)手术组大鼠肾间质炎性细胞弥漫性浸润，局灶性加重，肾小管明显扩张，小管内见大量细胞管型，肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性，肾小球、小血管未见明显病变;尿毒清组肾间质炎性细胞多灶性浸润，部分肾小管扩张、上皮细胞肿胀，空泡变性 (见图2)。小管管腔所占面积)，取其平均值进行比较。

表1 4组大鼠观察指标的水平比较 (±s)Table 1 Comparison of observation indexes among the four groups

表1 4组大鼠观察指标的水平比较 (±s)Table 1 Comparison of observation indexes among the four groups

注:与假手术组比较，*P＜0.01;与手术组比较，△P＜0.01;BUN=尿素氮，SCr=血肌酐，T－SOD=总超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛

组别 只数 BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)T－SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)正常对照组 6 3.9±1.6 52±11 261±51 1.8±0.4假手术组 6 3.9±1.7 54±11 255±54 1.8±0.3手术组 6 10.9±1.7* 89±13* 125±41* 4.0±0.8*尿毒清组 6 6.5±1.6＊△ 72±15＊△ 187±41＊△ 2.8±0.7＊△F 0.0000 0.0001 0.0001 0.0000 24.76 11.40 11.70 18.13 P值值

表2 4组大鼠TGF－β1mRNA的表达水平 (±s)Table 2 Levels of TGF－β1mRNA among the four groups

表2 4组大鼠TGF－β1mRNA的表达水平 (±s)Table 2 Levels of TGF－β1mRNA among the four groups

注:与假手术组比较，*P＜0.01;与手术组比较，△P＜0.01

mRNA正常对照组 6 0.198±0.035组别 只数 TGF－β1假手术组 6 0.201±0.004手术组 6 0.775±0.014*尿毒清组 6 0.519±0.029＊△F 值0.0000 818.36 P值

2.5 肾组织TLR4蛋白的表达 TLR4在正常大鼠肾脏组织中主要分布在肾近曲小管、远曲小管、集合管、肾间质区、肾血管等部位，在肾小球系膜区也有一定的表达。4组大鼠肾组织中TLR4表达水平的比较，差异有统计学意义 (P＜0.01)。其中，假手术组与手术组、手术组与尿毒清组的TLR4表达水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表3，图3)。

表3 4组大鼠肾组织中TLR4表达水平 (± s，%)Table 3 Semi－quantitative analysis of TLR4 proteins by immunohistochemistry in rat kidney of the four groups

表3 4组大鼠肾组织中TLR4表达水平 (± s，%)Table 3 Semi－quantitative analysis of TLR4 proteins by immunohistochemistry in rat kidney of the four groups

注:与假手术组比较，*P＜0.01;与手术组比较，△P＜0.01

组别 只数TLR4正常对照组 6 3.35±0.27假手术组 6 3.57±0.47手术组 6 9.10±0.46*尿毒清组 6 6.40±0.65＊△F 值0.0000 190.31 P值

图1 TGF－β1mRNA在4组大鼠肾组织的表达Figure 1 TGF－β1mRNA expression of rat kidney of the four groups

图2 3组大鼠肾组织HE染色 (×100)Figure 2 HE staining of rat kidney in three groups

图3 3组大鼠肾组织中TLR4表达 (免疫组织化学法，×200)Figure 3 TLR4 expression by immunohistochemistry of rat kidney in three groups

3 讨论

RIF是导致各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同通路。大量的研究均证实肾小管－间质的损害程度与慢性肾脏疾病 (chronic kidney disease，CKD)患者的肾功能损害程度呈正相关［3］。UUO是目前常用的肾小管间质损伤模型之一，是主要累及肾小管间质的非免疫源性进行性肾损害的实验动物模型。持续输尿管梗阻导致肾小管扩张和肾间质缺血，引起肾小管上皮细胞及血管内皮细胞损伤，继而出现以单核、淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞数量减少和间质纤维组织增生，进而发展为小管萎缩和间质纤维化［4］。

Toll基因最早在果蝇中发现，基因产物表达于细胞膜上，是一类跨膜受体。Toll基因除了参与调控胚胎果蝇背腹轴分化外，还介导果蝇抗真菌感染产生天然免疫反应。1997年，Medzhitov等［5］鉴定和克隆了人的一种果蝇 Toll基因同源体，命名为TLR4。人类TLR4是第一个发现的哺乳动物的Toll样受体。迄今为止在哺乳动物、人细胞膜上已发现有10种TLRs。TLR4的主要功能是作为脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)的信号转导受体，LPS是革兰阴性菌外膜的主要成分。TLR4可在内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞以及心肌细胞中表达。进一步研究发现TLR4不仅是LPS的主要受体，还能识别热休克蛋白60、纤维蛋白原、硫酸类肝素、纤维连接蛋白的EDA、透明质酸、Taxol等多种病原相关分子模式 (pathogen associated molecular pattern，PAMP)，产生不同的效应［6］。

TLR4介导的信号途径，包括MyD88的依赖性和非依赖性两个途径。MyD88依赖性途径主要介导NF－κB活化和细胞因子产生，而非依赖性途径主要负责IFN诱导性蛋白10(IFN－inducible protein 10)、糖皮质激素终止反应基因16(glucocorticoid attenuated response gene16，GARG16)、IFN调节基因 1(IFN－regulated gene1，IRG21) 表达和树突状细胞成熟［7］。活化的TLR4利用其胞质作用域与衔接蛋白MyD88的羧基末端相互作用，MyD88用它的死亡域 (death domain)募集下游同样含死亡域的丝/苏氨酸蛋白激酸酶 (serine/threonine－kinase)，通过丝/苏氨酸蛋白激酶的三级酶联MAPKKK(mitogen－activated protein kinase kinase kinase，或称 MAP3K)、MAPKK及MAPK启动细胞内信号传递，介导蛋白酪氨酸激酶和P38MAPK的激活而活化转录因子 (核因子－κB、AP－1、ATF2等)促进效应细胞表达合成肿瘤坏死因子－α、白介素－1、白介素－6及白介素－8等炎性因子［8］，引起一系列病理生理变化。

文献表明，在各种病因导致的肾脏损伤过程中，氧化应激起着重要的作用［9］。MDA是在氧自由基作用下发生脂质过氧化反应的一种产物，其本身也能破坏细胞膜的结构与功能，对细胞具有毒性，并能刺激间质细胞胶原基因表达，MDA量的变化提示体内脂质过氧化，间接反映细胞损伤的程度。SOD能清除超氧化物阴离子，可拮抗脂质过氧化，其活力的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力。氧化修饰的低密度脂蛋白和氧化的磷脂影响TLR4表达和TLR4信号转导。氧化的低密度脂蛋白上调TLR4表达。氧化的磷脂 (ox－PAPC)通过TLR4介导诱导白介素－28转录［10］。氧化应激可能通过TLR4加重肾间质炎症和免疫反应。本研究结果表明在手术组大鼠，肾功能受损，肾小管间质病变中氧化应激增加，致纤维化因子——TGF－β1的表达明显增多，表明TGF－β1的高水平表达加速RIF的进程。TLR4在正常大鼠肾脏组织中主要分布在肾近曲小管、远曲小管、集合管、肾间质区、肾血管等部位，在肾小球系膜区也有一定的表达。手术组大鼠TLR4在上述区域的表达显著升高，尤其以肾小管及肾间质区增加最为明显。

尿毒清颗粒由大黄、黄芪、甘草、茯苓、川芎、丹参、白术、制何首乌、姜半夏等组成，具有扶正益气、祛浊解毒、化瘀生新作用。尿毒清颗粒作为中药复方制剂，具有多因素、多靶点、综合表现药效的特点。其中主要成分大黄具有抑制细胞因子、生长因子生成，抑制肾小球系膜细胞增生及成纤维细胞增殖的作用。

本研究结果表明在尿毒清治疗后氧化应激指标下调，RIF减轻。氧化应激反应产物可能作为内源性的TLR4配体，通过激活TLR4，诱导核因子κB激活，启动白介素－1、白介素－6、白介素 －8、白介素 －12、肿瘤坏死因子 －α和 CD80与CD86等基因的转录，介导各种病原体的识别和免疫活化过程从而导致肾脏损伤。因此，在慢性肾衰竭的预防与治疗中，抑制自由基的产生，清除已产生的自由基及加强抗自由基等方法可作为抗RIF有效的措施。

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6 Maris NA，Dessing MC，Vos AF，et al.Toll like receptor mRNA levels in alveolar macrophages after inhalation of endotoxin［J］.Eur Respir J，2006，28:622 －626.

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