Akt/mTOR信号通路蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义

晏 淼，朱正秋，卞保祥，郑义同

胃癌的死亡率在世界范围内居高不下，主要原因之一是胃癌的治疗进展缓慢，手术、放疗及化疗均不能取得满意效果，最终死于肿瘤复发及转移。自从靶向治疗问世后，获得了学者的广泛关注，也取得了不错的效果。目前，信号传导系统的缺陷和异常活化与肿瘤发生、发展及预后的关系已成为肿瘤分子生物学的研究热点，通过干预信号传导途径治疗也成为生物治疗的新兴领域。在这些信号传导通路中，Akt/mTOR信号通路是关键的细胞增殖相关信号通道之一，其活性的明显增强与许多恶性肿瘤的发生、发展密切相关。本研究采用PV－9000二步法免疫组化检测Akt/mTOR信号通路蛋白在胃癌组织中的表达情况，并结合临床病理特征进行探讨，以期为下一步临床应用提供理论及实践基础。

1 材料与方法

1.1 病例纳入标准 (1)组织病理学诊断结果经2名以上病理医师确诊为胃癌，胃癌的组织学类型以世界卫生组织(WHO)分类2000为准;(2)有明确的胃癌TNM分期和组织学分级，以美国癌症联合会 (AJCC)2010年第7版为准;(3)行根治性手术;(4)术前均未经放疗或化疗。

1.2 标本 收集2009年9月—2010年9月连云港市第一人民医院手术切除的胃癌蜡块标本93例 (实验组)，病例均符合上述纳入标准。其中男67例，女26例;年龄26～83岁，平均61岁。从93例患者中随机抽取40例，取其癌旁组织 (距肿瘤组织边缘5 cm以上)作为对照组，其中男26例，女14例;年龄36～79岁，平均61岁。

1.3 主要试剂及方法 兔抗人多克隆抗体p－Akt、兔抗人单克隆抗体p－mTOR、PV－9000检测试剂均购自北京中杉生物技术有限公司。采用PV－9000二步法免疫组化检测，实验步骤按照说明书严格操作，用PBS代替一抗做阴性对照。必须同时满足以下条件才能判断为阳性，否则为阴性:(1)阳性细胞定位明确;(2)间质清晰、无背景着色;(3)阳性细胞占5%以上。

1.4 统计学方法 采用SPSS l7.0软件进行统计检验。计数资料采用χ2检验，并行Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p－Akt、p－mTOR在胃癌组织和癌旁组织中的表达p－Akt、p－mTOR这两种蛋白阳性信号主要位于细胞质内。p－Akt、p－mTOR在实验组的胃癌组织和对照组的癌旁组织中的阳性表达率比较，差异有统计学意义 (P＜0.01，见表1)。

2.2 p－Akt、p－mTOR的表达与胃癌临床病理特征的关系93例患者分别按年龄、性别、病理分化程度、侵犯深度、淋巴结转移、TNM分期分组，分别统计组间p－Akt、p－mTOR的表达情况。结果显示，不同分化程度、侵犯深度、淋巴结转移、TNM分期组组织中p－Akt、p－mTOR的表达差异有统计学意义 (P＜0.05)，而在年龄、性别不同分组中的表达间差异则无统计学意义 (P＞0.05，见表2)。

表1 实验组和对照组中p－Akt、p－mTOR的表达［n(%)］Table 1 Expression of p－Akt and p－mTOR in the observed group and the control group

表2 p－Akt、p－mTOR阳性表达与胃癌临床病理参数之间的关系Table 2 Correlations between positive expression of p－Akt and p－mTOR and clinicopathologic features of gastric carcinoma

2.3 p－Akt与p－mTOR在胃癌组织中表达的相关性Spearman相关分析显示，胃癌组织中p－Akt蛋白表达与pmTOR蛋白表达呈正相关 (r=0.327，P＜0.01，见表3)。

表3 93例胃癌组织中p－Akt、p－mTOR的表达 ［n(%)］Table 3 Expression of p－Akt and p－mTOR in 93 gastric carcinomas specimens

3 讨论

3.1 Akt/mTOR信号通路是关键的细胞增殖相关信号通道之一，其活性增强与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关［1］。Akt又被称为蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一个在进化上高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物细胞中存在着3种Akt异构体 (Akt 1～3)，这3种由不同基因编码的蛋白拥有80%的序列一致性，并且功能大部分相同。Akt通过残基Thr308和Ser473的磷酸化而被激活，Akt的活性在多种恶性肿瘤中被放大，其异常激活意味着肿瘤细胞对于凋亡诱导的耐受，细胞增殖、生长、代谢的异常增加。有研究发现Akt磷酸化主要发生在胃癌，激活后能延长细胞的生存寿命和增加细胞的增殖，进而促使肿瘤发展和血管生成［2］。磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K) 抑制剂 LY294002能抑制Akt的活性，从而抑制胃癌细胞的生长和增殖，诱导细胞周期G1期停滞。因此，Akt不仅是一个有活性的激酶，并且能促进胃癌的发展和增殖。Paweletz等［3］检测疾病发展中的分子标志物，发现从正常细胞到不典型增生再到恶性转化，Akt的激活水平渐次增加，而且伴随凋亡相关分子标志物丢失，支持Akt在肿瘤发展中提高肿瘤生存能力的理论。周诗琼等［4］研究发现早期胃癌、中晚期胃癌的癌组织中Akt蛋白的阳性表达率均较正常胃黏膜组织高，差异有显著性。

本研究结果显示，p－Akt在胃癌组织中的阳性表达率为54.8%(51/93)，较癌旁组织 (2.5%)高;低分化及未分化(G3+G4)的胃癌组织中p－Akt阳性表达率高于高、中分化(G1+G2)组织，侵犯深度为穿透浆膜层 (T4)的组织p－Akt阳性表达率高于未穿透 (T1+T2+T3)的组织，有淋巴结转移 (N1+N2+N3)的胃癌组织p－Akt阳性表达率高于无淋巴结转移 (N0)的组织，TNM分期为Ⅲ期和Ⅳ期的高于Ⅰ期和Ⅱ期的。p－Akt蛋白的表达与胃癌细胞的分化程度有关，可能是因为Akt蛋白的过度扩增促进肿瘤细胞分化、进展。随着肿瘤侵犯突破浆膜层、出现淋巴结转移、临床分期的提高，p－Akt蛋白的表达阳性率增高，提示p－Akt蛋白的表达促进了胃癌细胞的浸润、转移，其机制可能是Akt通过激活其底物来增加细胞周期素 (cyclin)D转录，还可以通过磷酸化p2lCIPI使细胞周期加速，促进肿瘤发展。

3.2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)是一个非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其C末端与PI3K的催化结构域高度同源，因此也属于磷脂酰肌醇激酶相关蛋白家族。mTOR可以整合氨基酸、能量、生长因子所激发的信号通路，借以调控细胞生长增殖和细胞周期，通过控制其下游与翻译、转录有关的多种蛋白的磷酸化来发挥其生物学作用，在细胞的生存、生长和增殖中起中心调控作用，其转导的信号通路异常与多种肿瘤的形成密切相关［5］。Lang等［6］研究发现mTOR信号通路在胃癌组织中表达升高，且雷帕霉素可抑制胃癌细胞的生长和迁徙，并抑制小鼠胃癌生长。孙丹凤等［7］研究也发现雷帕霉素干预后可使胃癌细胞生长受到抑制，随着时间的增加抑制效应更显著，证实mTOR信号通路在胃癌细胞中也发生改变，可能成为一种潜在的治疗靶点。

本实验检测p－mTOR在胃癌组织中的阳性表达率为57.0%(53/93)，显著高于癌旁组织中的阳性表达率(2.5%)，提示这种蛋白可能与胃癌的发生有关。而且pmTOR的表达与肿瘤侵犯深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期密切相关。结果表明，p－mTOR的阳性表达率随着胃癌的浸润、转移等进展而上调，提示他们可能参与了胃癌的发生以及浸润转移的分子机制，mTOR通过PI3K/Akt信号传导链而作用于细胞分裂、转录、信号翻译等细胞增殖的重要环节，从而促进肿瘤的发展。

此外，本研究中Spearman相关分析显示，胃癌组织中p－Akt蛋白表达与p－mTOR蛋白表达呈正相关，可能的原因是它们在胃癌的发生、发展中存在着协同作用。

3.3 随着人们逐渐认识到细胞癌变的本质是细胞信号转导通路的失调导致的细胞无限增殖，随之而来的就是抗肿瘤药物研发焦点正在从传统细胞毒药物转移到针对肿瘤细胞内异常信号系统靶点的特异性的抗肿瘤药物［8］。本实验也为Akt/mTOR信号通路蛋白的相关抑制剂有望成为胃癌新的治疗靶点提供了理论依据。Akt抑制剂哌立福新 (perifosine)、mTOR的抑制剂雷帕霉素及其类似物依维莫司 (RAD001)、CCI779、AP23573等已经分别进入各期临床研究［9－11］。其中，RAD001在既往化疗失败的转移性胃癌中应用的Ⅱ期临床试验正在进行中，令人期待［12］。Akt/mTOR信号通路蛋白在胃癌组织中的阳性表达与肿瘤的发生、发展、转移密切相关，有望成为预测胃癌转移的新分子标志物和治疗靶点。

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6 Lang SA，Gaumann A，Koehl GE，et al.Mammalian target of rapamycin is activated in human gastric cancer and serves as a target for therapy in an experimental model［J］.Int J Cancer，2007，120:1803 －1810.

7 孙丹凤，房静远，张燕捷，等.mTOR信号通路与组蛋白乙酰化在胃癌细胞中的相互作用 ［J］.中华医学遗传学杂志，2007，24(4):387－391.

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