实时定量聚合酶链反应检测人半翼基因在宫颈病变中的表达及意义

卢博奇，蔺 莉

宫颈癌是妇科疾病中最常见的恶性肿瘤之一，每年有近30万新发宫颈癌病例，总体5年生存率约为52%。发达国家如美国每年约有1万例宫颈癌新发病例，而中国每年约有8～10万例宫颈癌新发病例，死亡率位居中国女性癌症的第二位［1］。宫颈癌近年来呈现年轻化趋势，其发病机制尚不明确，但很多研究证明99%的宫颈癌组织中可检出人乳头瘤病毒(HPV)。目前普遍接受的观点是:HPV是宫颈癌的主要致病因子［2－3］。然而在感染 HPV的妇女中，大多数可自行消退，仅少数妇女发展为持续性感染并进展为宫颈上皮内瘤样变(CIN)甚至宫颈癌。但宫颈癌患者并非都有HPV的感染，说明在宫颈癌的发生过程中，还有其他一些因素发挥作用［4］。人半翼 (hWAPL)基因是近年来发现的与宫颈癌及HPV关系十分密切的一个基因［5－6］，研究表明hWAPL基因在宫颈癌中特异性高表达［6］。本研究在分子水平上采用实时荧光定量聚合酶链反应 (PCR)测定宫颈中hWAPL基因的表达水平，探讨hWAPL基因表达与宫颈病变之间的关系，为探索宫颈癌的早期诊断方法提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象 收集2007年3月—2009年1月首都医科大学附属北京友谊医院门诊行阴道镜检查、取材并经病理检查证实的宫颈病变标本共100例，患者均未经任何物理、化学、放射治疗及手术治疗，包括慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌各20例。病理结果均由北京友谊医院病理科证实。阴道镜下取材的宫颈组织先保存于液氮中，后转移至－80℃冰箱保存。

1.2 试验步骤

1.2.1 总RNA提取 每个样本取冻存组织50～100 mg，使用总RNA提取试剂盒〔天根生化科技 (北京)有限公司〕，用离心柱法进行总RNA提取。将RNA在1%琼脂糖中进行电泳检测其完整性，可见28S及18S两条清晰条带。

1.2.2 逆转录合成cDNA

1.2.2.1 引物设计及合成 根据Gene bank中hWAPL基因及β－actin基因 (看家基因)序列，应用Primer Express 3.0软件设计引物，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下:hWAPL基因上游为GATAAGAGTGGAGAGTGGCAA，下游为ACCCAAGAAGTAGTGCTGTGT，产物长度194 bp;β－actin基因上游为TCAAGATCATTGCTCCTCCTG，下游为TCATAGTCCGCCTAGAAGCAT，产物长度160 bp。

1.2.2.2 cDNA第一链的合成 使用美国Promega公司MMLV逆转录酶，建立25 μl反应体系:M－MLV 5×缓冲液5 μl，dNTP混合物 (10 mM)3 μl，RNasin核糖核酸酶抑制剂1 μl，M － MLV 逆转录酶 1 μl，Poly(T) 引物 (10 μM)1 μl，总 RNA(1 μg/μl)1 μl，RNase － free H2O 13 μl; 反应条件:25℃ 5 min，37℃ 1 h，95℃ 10 min。cDNA用于PCR反应或保存于－20℃备用。

1.2.3 实时定量PCR检测

1.2.3.1 标准曲线的制定 为校正定量过程中不同样品RNA中mRNA含量的差异，选用β－actin基因作为内参照对RNA含量的变异进行校正。以cDNA为模板，β－actin基因为引物进行扩增，β－actin基因 PCR产物进行纯化、连接转化、提质粒，并对β－actin基因质粒原液进行定量，将此质粒原液作为标准曲线中最高的模板 (1011拷贝)，然后将其逐次10倍稀释成1010、109、108、107、106、105、104和 103用于标准曲线的制作。

采用SYBR GreenⅠ荧光染料掺入法，进行实时定量PCR反应。每个样品做两个平行，并设有双蒸水空白对照。

1.2.3.2 实时定量PCR反应 使用美国ABI公司的实时荧光定量PCR试剂盒，采用总体积15 μl反应体系:SYBR Green Master Mix 7.5 μl，去离子水 4.5 μl，上游引物 1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl。反应条件:25 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40个循环。以β－actin基因作为内参照进行PCR。PCR扩增完成后，采用计算机软件 (7300 System Software Applied Biosystem)分析各反应的荧光强度，得出反应的临界循环数 (CT)值并自动绘制β－actin的标准曲线，参照标准曲线，得出目的基因的相对反应起始拷贝数。hWAPL基因mRNA相对表达量=hWAPL基因拷贝数/β－actin基因拷贝数。

2 结果

2.1 hWAPL基因在慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组及宫颈癌组中均有表达。逆转录合成的特异性hWAPL基因cDNA经常规PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳显示在194 bp处有清晰条带 (见图1)。

图1 逆转录合成hWAPL基因的cDNA PCR扩增电泳图Figure 1 Electrophoresis of cDNA PCR amplification for Reverse transcription hWAPL

2.2 实时定量PCR结果

2.2.1 慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈癌组中hWAPL基因mRNA相对表达量逐渐增多，5组比较，差异有统计学意义 (F=9.47，P=0.00)。其中CINⅢ组和宫颈癌组与慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组3组比较差异均有统计学意义 (P＜0.05)，慢性宫颈炎组、CINⅠ组和CINⅡ组hWAPL基因mRNA相对表达量明显低于宫颈癌组和宫颈癌组;宫颈癌组与CINⅢ组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

表1 宫颈组织hWAPL mRNA相对表达量比较 (±s)Table 1 hWAPL mRNA expression in cervical lesions

表1 宫颈组织hWAPL mRNA相对表达量比较 (±s)Table 1 hWAPL mRNA expression in cervical lesions

注:*与CINⅢ组和宫颈癌组比较，P＜0.01;△与宫颈癌组比较，P＞0.05

mRNA慢性宫颈炎组 20 1.05±0.68组别 例数 hWAPL基因*CINⅠ组 20 3.05±1.57*CINⅡ组 20 4.48±2.25*CINⅢ组 20 8.71±7.70△宫颈癌组 20 10.49±9.82

2.2.2 实时定量PCR标准曲线和融解曲线 标准曲线相关系数0.996，＞0.99，标准点有5个，融解曲线显示只有一个大峰，没有引物二聚体。均证明引物设计准确，特异性好，产物扩增效率良好，定量结果可靠 (见图2～4)。

图2 标准曲线Figure 2 Standard curve

图3 hWAPL融解曲线Figure 3 hWAPL dissociation curve

图4 β－actin融解曲线Figure 4 β－actin dissociation curve

3 讨论

半翼 (WAPL)基因是1977年发现的果蝇体内的X连锁基因序列［7］，是果蝇体内调节异染色质组织的基因产物。hWAPL基因是果蝇体内WAPL基因在人体内的同源序列，定位于10q23.2，编码一种聚合锚定蛋白，有利于其在分裂前期适时从染色体臂解离。Hela细胞中WAPL基因的缺失导致分裂前中期同源染色体细胞瞬间聚集，其中两个姐妹染色单体的解离存在严重的缺陷。当两个姐妹染色单体彼此聚合的时候，染色质中心轴的聚合蛋白呈现高水平。聚合蛋白的减少减轻了WAPL基因缺失表型，并且使人动点蛋白 (Sgo1)和粘连蛋白(Esco2)缺失的细胞中过早分离的姐妹染色单体还原［8］。相反的，WAPL基因的过度表达反而使姐妹染色单体过早解离，并且扰乱有丝分裂和胞质分裂，从而诱导染色体的不稳定性，促进肿瘤的形成［5－9］。Oikawa等［10］从良性宫颈上皮、宫颈非典型增生上皮和浸润性宫颈癌中分离出并确定了WAPL突变型，并利用Northern印迹技术对宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌及其相应的正常组织中的hWAPL基因mRNA表达水平进行检测，发现相对于其他癌组织及其相应的正常组织，宫颈癌中hWAPL基因mRNA表达升高十分明显［5］。利用免疫组化技术对正常宫颈上皮、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组织中hWAPL的表达进行对比，发现hWAPL基因在所有检测的标本中均有表达，但在正常宫颈上皮中的表达仅限于基底层;在CINⅠ～Ⅲ级和宫颈癌组织中的表达逐渐增加。

Oikawa等［5］还用血凝素 (HA)标记的hWAPL表达载体(HA－hWAPL 3T3)或HA表达载体 (HA－3T3)转染宫颈癌NIH3T3细胞，然后比较HA－hWAPL 3T3和HA－3T3细胞在裸鼠中生成肿瘤的能力。结果发现所有注射HA－hWAPL 3T3细胞的裸鼠均在注射10 d后有肿瘤生成，而在HA－3T3注射的裸鼠体内无一例发生肿瘤，表明hWAPL具有癌基因的特征。

曹利仙等［11］在hWAPL基因序列中选取了两处作为干扰靶点，将含9个碱基环结构的退火双链与含U6启动子的真核表达载体相连，成功构建针对WAPL基因的shRNA长效真核表达载体。经酶切和测序鉴定表明成功构建了3个pGenesilhwAPL－shRNA，采用脂质体法转染宫颈癌CaSki细胞后，在倒置荧光显微镜下观察到大量绿色荧光蛋白表达。实时定量PCR检测结果表明，筛选到的短链WAPL基因siRNA能有效抑制内源hWAPL基因的表达。说明该shRNA真核表达载体能特异地降低宫颈癌CaSki细胞hWAPL基因mRNA水平，起到转录后基因沉默作用，抑制宫颈癌细胞恶性增殖。

本研究应用实时荧光定量PCR法检测慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组织中hWAPL基因mRNA表达量，结果表明，在所有实验组中均有hWAPL基因mRNA表达，并且随着宫颈病变程度的加重，hWAPL基因mRNA表达量逐渐上升，在宫颈癌组中的表达明显高于宫颈炎组、CINⅠ组和CINⅡ组，说明hWAPL基因在宫颈癌的发生、发展中可能起着极其重要的作用。本研究结果显示，CINⅢ组和宫颈癌组中hWAPL基因mRNA表达量无明显差异，但在临床的诊疗中，CINⅢ和宫颈癌的治疗方法的选择和随访均有较大的差别，能否将hWAPL基因mRNA表达量的高低作为判断宫颈病变程度的可靠指标，仍需进一步的研究来证实，hWAPL基因在宫颈癌中的具体作用机制将成为以后研究的主要任务。

1 黄莫婉，马英.宫颈癌研究新进展 ［J］.重庆医学，2006，35(23):2185－2187.