肾癌中KISS-1与E-cadherin的表达及调控关系

张辉，宋永胜，吴斌

（中国医科大学附属盛京医院泌尿外科，沈阳 110001）

肾癌是泌尿系中最常见的恶性肿瘤之一，仅次于膀胱肿瘤，约占肾脏恶性肿瘤的85%。既往肾癌就诊时20%～35%已有转移，6%～15%是因为转移症状而就诊［1］，因此加强对肾癌转移的分子机制的研究尤为重要。KISS-1基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因，能明显抑制肿瘤细胞的化学趋向性和侵袭性，并限制肿瘤细胞的迁移、蠕动功能［2］。本研究拟应用实时PCR检测KISS-1基因和上皮细胞钙粘蛋白（epithelia cadherin，E-cadherin）在肾癌中的表达，并研究KISS-1对肾癌细胞Caki-1中E-cadherin的调控作用。

网络出版时间：2011-09-26 12:08

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

所有组织标本均来源于2007-2010年中国医科大学附属盛京医院泌尿外科患者，包括53例原发未转移肾癌和46例原发伴转移肾癌。患者年龄47～63岁，行经腹腔根治性肾切除术，经病理诊断证实为肾透明细胞癌，均未接受放疗和化疗。组织标本切除后浸入RNAlater，放入-80℃冰箱中保存。人肾癌细胞系Caki-1为本实验室保存；重组真核表达载体pIRES2-KISS1为本实验室前期研究构建。总RNA抽提试剂TRIZOL和转染试剂Lipofectamin 2000购自Invitrogen公司，大肠埃希菌DH5α、逆转录试剂盒和实时PCR试剂盒购自TaKaRa公司，无内毒素质粒中提试剂盒购自北京天根公司，抗KISS-1和E-cadherin抗体购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中山公司，Western blot相关试剂购自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 实时PCR：TRIZOL法提取总RNA，逆转录成cDNA。以β-actin为内参基因，按照试剂盒说明书扩增KISS-1和 E-cadherin基因，KISS-1上游引物：5′-TTCCTCTGTGCCACCCACTT-3′， 下 游 引 物 ：5′-GCAGTAGCAGCTGGCTTCCT-3′；E-cadherin 上游引物：5′-GCTTCCCTCTTTCATCTCCT-3′，下游引物：5′-TAGTTCCGCTCTGTCTTTGG-3′。应用 ABI公司的7500 Real-time PCR仪，7500 Software v2.0软件。实验获得数据采用比较CT值法（2-ΔΔCT法）进行相对定量分析。计算公式：（1）改变的倍数＝2-ΔΔCT；（2）ΔΔCT＝ΔCT肿瘤组-ΔCT癌旁组；（3）ΔCT＝CT靶基因-CT内参。结果为相对于对照组实验组中靶基因的表达相对于内参的改变倍数。

1.2.2 提取无内毒素重组载体：将表达载体pIRES2-KISS-1转化大肠埃希菌DH5α，接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌液，采用无内毒素质粒中提试剂盒，按照说明书抽提无内毒素重组载体。

1.2.3 载体转染：Caki-1细胞以5×104/孔转种于6孔培养板中，培养至细胞80%～90%融合。按转染试剂说明书进行转染，继续培养48 h后收集细胞进行Western blot检测。

1.2.4 Western blot：未转染的Caki-1细胞为空白对照组，转染pIRES2的Caki-1细胞为阴性对照组，转染pIRES2-KISS1的Caki-1细胞为实验组。提取待测细胞蛋白，定量，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后将PVDF膜先后与一抗和二抗孵育，与ECL发光底物结合后显影、成像。经GDS凝胶成像分析系统进行光密度分析，目的条带的光密度与内参蛋白β-actin的光密度的比值即为目的蛋白表达的相对值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 实时PCR检测肾癌组织中KISS-1和E-cadherin mRNA的表达

通过引物溶解曲线分析，KISS-1基因扩增成功。结果显示，KISS-1mRNA在原发未转移肾癌和原发伴转移肾癌组织中的△CT分别为4.372±0.518与 5.841±0.487，ΔΔCT为 1.469，伴转移组中 KISS-1 mRNA较未转移组明显下调，为未转移组表达量的36.1%，差异有统计学意义（P<0.05）。而E-cadherin mRNA 的△CT分别为 3.647±0.438与 4.904±0.548，ΔΔCT为 1.257，E-cadherinmRNA 在伴转移组中表达明显下调，为未转移组表达量的41.8%，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 KISS-1和E-cadherin的相关性分析

通过Pearson相关分析，KISS-1和E-cadherin的表达水平呈负相关（r=-0.735，P<0.05）。

2.3 Western blot检测 RNA干扰Caki-1细胞中KISS-1和E-cadherin蛋白的表达

空白对照组、阴性对照组和实验组细胞中KISS-1蛋白的相对表达分别为0.473±0.052、0.446±0.048和1.138±0.074，E-cadherin蛋白的相对表达分别为 0.564±0.061、0.587±0.068 和 1.263±0.087（图1）。与空白和阴性对照组相比，实验组细胞中KISS-1和E-cadherin蛋白的表达均明显上调，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

KISS-1基因是由Lee等［3］在人类黑色素细胞株中发现的一种肿瘤转移抑制基因，定位于染色体1q32-q41。KISS-1基因能明显抑制肿瘤细胞的化学趋向性和侵袭性，并限制肿瘤细胞的迁移蠕动功能［2］。KISS-1基因在乳腺癌和胃癌等多种肿瘤中存在转移抑制作用［4，5］。最新的研究表明，KISS-1 基因高表达在胆囊癌和胰腺癌患者中均有较好的预后［6，7］。本研究应用实时PCR检测发现，与原发未转移肾癌相比，KISS-1mRNA在原发伴转移肾癌组织中的表达明显下调。KISS-1基因与肾癌的转移相关，可能在肾癌的转移过程中发挥抑制作用。我们前期的细胞水平研究发现，沉默肾癌769-P细胞中KISS-1基因的表达能够增强769-P细胞的侵袭能力［8］。因此，研究证实KISS-1基因在肾癌中具有抑制肿瘤细胞侵袭转移的功能。

E-cadherin属于钙粘蛋白家族，它广泛存在于各类上皮细胞中，通过胞浆连环蛋白与细胞骨架蛋白相连，是介导细胞之间以及细胞与细胞外基质粘附的主要分子之一［9］。有研究报道，E-cadherin由于启动子区甲基化等原因造成的表达下调，与多种肿瘤的转移相关［10，11］。本研究发现，与原发未转移肾癌相比，E-cadherinmRNA在原发伴转移肾癌组织中的表达明显升高。E-cadherin基因与肾癌的转移相关。进一步的统计分析显示，在全部的肾癌组织中KISS-1和E-cadherin的表达呈正相关，二者之间可能有内在的调控关系。

我们将表达载体pIRES2-KISS1转染肾癌Caki-1细胞，上调其中KISS-1蛋白的表达，Western blot检测证实E-cadherin蛋白显著上调。肾癌细胞中KISS-1和E-cadherin存在正性调控的关系，KISS-1的表达改变能够影响E-cadherin的表达。综上所述，我们认为KISS-1基因能够通过上调E-cadherin的表达发挥其肿瘤转移抑制基因的作用，进一步的深入探讨将为研究肾癌的转移机制提供新的理论依据，而且能够为肾癌的治疗提供新靶点。

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