冬凌草醇提物腹腔注射给药急性毒性试验*

蒋征奎，杨正武，王随华，李寅超，刘宏民，郭 琰，吴翠萍，刘学武，赵宜红，高珊珊

(1.郑州大学附属肿瘤医院，河南郑州450003;2.西峡县米萍乡卫生院，河南西峡474598;3.郑州大学药学院，河南 郑州450052)

冬凌草［Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara.］系唇形科植物碎米桠的干燥全草，又名冰凌花，为河南区域特色中药，味甘、苦，性微寒，有清热解毒、活血止痛功能［1］。目前，冬凌草作为治疗食管癌与贲门癌的特效中草药已被国内中医药界认可。冬凌草醇提物对体外培养的HeLa细胞和食管癌细胞均有一定的细胞毒作用，也能抑制各种动物肿瘤的生长［1］。前期本课题组对冬凌草醇提物灌胃给药的急性毒性进行了研究［2］，为进一步明确其安全性，又开展了冬凌草醇提物对小鼠单次腹腔注射(ip)给药的毒性实验。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠94只，雌雄各半，体质量(20±2)g，由河南省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(豫)2005－0001，动物质量合格证号为0003857。饲料、饮水、垫料均符合卫生标准。小鼠饲养于郑州大学药学院SPF级实验动物房，实验动物使用许可证号为SYXK(豫)2007－0009。小鼠实验前先喂养1周，为适应期。

1.2 药物与试剂

冬凌草(碎米桠)采集于河南省济源市山区，经郑州大学药学院刘若庸教授鉴定为唇形科香茶菜属植物碎米桠Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara.。冬凌草醇提物由郑州大学新药研发中心制备，每克冬凌草醇提物相当于冬凌草原生药材21.71 g;放置于4℃冰箱备用，用前以大豆油(供注射用)配成所需浓度的混悬液。大豆油，供注射用，购于江西金海棠药用油有限公司批号2008701。

1.3 预试验

1.3.1 首次预试验

取12只小鼠，按体质量、性别分层随机法分为3组，每组4只，雌雄各半。冬凌草醇提物剂量等比级数1∶0.5。分别为:预试 1 组(590 μg/g)、预试2 组(295 μg/g)、预试 3 组(148 μg/g)。禁食(不禁水)12 h后，各组均按20 μL/g的容量 ip 1次，给药后记录动物的即时反应并连续观察7 d。结果不能确定小鼠死亡率(P)为0%的剂量(Dn)，因此须进行二次预实验以确定。结果见表1。

1.3.2 二次预试验

本次预试验所取动物数、分组数、各组ip容量等均同前，剂量等比级数为1∶0.5，分别为:预试1组(295 μg/g)、预 试 2 组 (148 μg/g)、预 试 3 组(75 μg/g)。禁食(不禁水)12 h后，1次 ip给药，然后观察记录动物的即时反应，连续观察7 d。结果见表1。

1.3.3结果

综合两次预试验结果，以295 μg/g的剂量 ip后，P=1;以 75 μg/g 的剂量 ip 后，P=0。由此，本实验确定冬凌草醇提物最大给药剂量(Dmax)约为295 μg/g，最小给药剂量(Dmin)约为 75 μg/g。

1.4 正式试验

根据上述预实验结果，按Bliss法设计，在Dmax(295 μg/g)～ Dmin(75 μg/g)的剂量(含 Dmax和Dmin)范围内设6个剂量组，根据文献［3］公式计算得到剂量比值为0.76。取70只小鼠，适应性饲养7 d后，按体质量、性别分层随机法分为7组，每组10只，雌雄各半。冬凌草醇提物剂量等比级数为1∶0.76，给药 1 ～6 组的剂量依次为 295，224，170，130，99，75 μg/g;空白对照组给予等容积的溶媒(即注射用大豆油)。禁食(不禁水)12 h后，各组均按20 μL/g一次性ip，给药后记录动物的即时反应。连续观察14 d，记录动物毒性反应出现时间及恢复时间、死亡情况以及死亡分布时间，并分别于给药前和给药后第7，14 d称量存活动物体质量。死亡或濒死动物及时进行尸检。

表1 两次预试验的剂量及小鼠的死亡率

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠一般状况观察

单次腹腔注射不同剂量的冬凌草醇提物后，多数动物即时呈现扭体、伏卧、竖毛、精神萎靡等异常症状。随时间推移，大部分存活动物出现行动迟缓、眼睛有分泌物、体形消瘦、肛周污秽等症状。给药剂量不同，存活动物异常症状恢复的时间有所差异:给药3组和4组存活小鼠在4 d后、给药5组和6组存活小鼠在2 d后，异常症状开始趋向恢复。给药剂量不同，动物死亡分布时间也有所差异:给药1组和2组动物在给药后1～3 h死亡，给药3组动物在给药后3～5 h死亡，给药4组动物在给药后3～10 d死亡。大部分动物死前出现挣扎、张口、呼吸困难症状，个别动物出现角弓反张等。对死亡或濒死小鼠立即行尸体解剖，裸眼下观察发现，心、肝、肾、肺、脑、脾、胸腺等重要器官均无明显异常，但多数动物十二指肠充血。对存活小鼠连续观察14 d，结果动物一般情况良好，未见其他毒性反应出现。14 d后对存活小鼠行尸体解剖，裸眼下观察心、肝、肾、肺、脑、脾、胸腺等重要器官，发现给药3组和4组存活小鼠呈现肝脏边缘略钝厚、少数有与腹腔膜粘连现象，余未有明显异常发现。

2.2 各组小鼠体质量变化

给药1组和2组动物在给药后1 d内全部死亡，其余各组存活小鼠给药第7，14 d的体质量见图1。各给药组存活小鼠的体质量与空白对照组对比，差别均无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 LD50的计算

实验完毕，将所得数据(见表2)用Bliss法求得冬凌草醇提物 ip给药的 LD50为148.71 μg/g，其95%可信限为130.56～169.47 μg/g。急性毒性正式试验的各组给药剂量与小鼠死亡率见表2。

图1 各组小鼠体质量增长情况

表2 急性毒性正式试验的各组给药剂量与小鼠死亡率对比

3 讨论

在预试验中，冬凌草醇提物对小鼠的0%(Dmin)剂量和100%(Dmax)致死剂量分别为75 μg/g 和 295 μg/g。正式试验时，最小给药剂量99 mg/g得到了与预试验相同的0%死亡率，而在给药剂量为224 mg/g时即得到了100%死亡率。因此，在计算 LD50时采用的 Dmax为224 mg/g、Dmin为99 mg/g。因冬凌草醇提物在水或食用油中溶解性较差，经反复试验，确定将冬凌草醇提物经真空冷冻干燥后研粉，均匀混悬于注射用大豆油中用于实验。

中药毒性与LD50呈负相关［4］。前期本课题组按Bliss法设计测得冬凌草醇提物灌胃给药的LD50为1.992 3 mg/g，按含生药量计算约为43.25 mg/g［2］。本实验进一步观察了冬凌草醇提物腹腔注射给予小鼠的急性毒性反应，结果显示，冬凌草醇提物ip给药的LD50为0.148 71 mg/g，按含生药量计算约为3.23 mg/g。有文献［5］认为，大毒中药 LD50＜5 g/kg，有毒中药 LD50介于5～15 g/kg，小毒中药 LD50介于16～50 g/kg，无毒中药 LD50＞50 g/kg。若以这种尚不完善的粗略的中药毒性分级方法判定，冬凌草醇提物灌胃给药毒性甚小，腹腔注射给药则毒性相对较大。

值得注意的是，急性毒性试验不只是LD50的测定，急性毒性试验结果仅提供LD50值是不够的。试验期间详细记录动物的毒性反应情况和死亡动物分布，尤其是中毒和死亡的发生时间、毒性反应的持续时间和恢复时间是十分必要的［5］。本实验结果显示:冬凌草醇提物给药剂量不同，存活动物异常症状恢复的时间和动物死亡分布时间均有所差异;给药后的各组存活小鼠第7天及第14天的体质量与空白对照组对比，呈平行增长，差别无统计学意义。尸体解剖发现，部分小鼠十二指肠色红充血。笔者考虑此与冬凌草具有活血作用［1］、冬凌草甲素可能有舒张外周血管的作用［6］有关，推测中毒剂量的冬凌草醇提物腹腔注射可能引起十二指肠黏膜水肿和充血而引发炎症反应。此外，本实验中给药3组和4组存活小鼠呈现肝脏边缘略钝厚、少数有与腹腔膜粘连现象，推测可能与腹腔注射对肝脏产生影响有关，此尚待进一步研究。

［1］侯士良.中药八百味详解［M］.郑州:河南科学技术出版社，2009:204－205.

［2］菅卫中，王随华，李寅超，等.冬凌草醇提取物单次灌胃给药毒性试验［J］.医药论坛杂志，2010，31(23):139－142.

［3］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1996:112.

［4］李寅超，赵宜红.辛夷挥发油半数致死量(LD50)的测定［J］.中国医院药学杂志，2009，29(21):1885－1886.

［5］关建红，翁维良.对中药“毒性”与毒性分级的思考［J］.中国中药杂志，2008，33(4):485 －487.

［6］李琦，刘洁，陈正.冬凌草甲素对家兔血流动力学的影响及其机理研究［J］.白求恩医科大学学报，1994，20(2):128－129.