肺癌组织中RKIP基因启动子区甲基化状态观察

齐 战，杨大运

(河北医科大学第四医院，石家庄 050011)

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族，参与对细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)、G蛋白偶联受体和NF-κΒ 信号通路的调控。研究发现［1，2］RKIP 在多种肿瘤中呈低表达或表达缺失，被作为是一种新的肿瘤转移抑制基因。2009～2011年，我们采用RTPCR和甲基化特异性PCR(MSP)法观察肺癌组织与相应癌旁肺组织中RKIP基因表达情况及其启动子区甲基化状态，分析RKIP基因表达及其甲基化状态与肺癌临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 83例新鲜肺癌手术标本(每例分别取癌组织及癌旁正常组织)，均经病理组织学检查证实。男48例，女35例;年龄33～75岁，平均53.7岁。其中吸烟(吸烟＞5支/d、连续＞2 a)者43例，非吸烟者40例。临床分期:Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期45例;有淋巴结转移者43例，无转移者40例。标本均于术中离体0.5 h内取材，立即置入液氮速冻罐中，于－80℃低温冰箱中保存备用。

1.2 RKIP基因及其甲基化率检测方法

1.2.1 RKIP基因 采用 RT-PCR法。用 Trizol一步法抽提肺癌及癌旁正常肺组织中总RNA，经DNA酶消化后逆转录，行PCR扩增。引物序列为RKIP:上游引物5'-GAATAGACCCACCAGCAT-3'，下游引物5'-CGTAAACCAGCCAGACAT-3';GAPDH:上游引物5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC G-3'，下游引物 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'。RKIP扩增条件:95 ℃ 3 min，94℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30 个循环，延伸72℃ 5 min，4℃终止，扩增片段长度为236 bp。取5 μl产物加1 μl溴酚蓝，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.2.2 DNA提取和亚硫酸氢钠修饰 采用蛋白酶K-苯酚抽提法提取肺癌及癌旁肺组织中总DNA［3］紫外分光光度计检测总DNA含量和纯度(A260/A280＞1.8)，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。亚硫酸氢盐处理修饰，用DNA纯化试剂盒纯化(按说明书操作)后，将DNA重悬于50 μl水中，水浴、沉淀、回收、干燥后，重悬于50 μl水中，－20℃用箔包裹保存。用正常人外周血淋巴细胞抽提的DNA行亚硫酸氢盐处理后作为未甲基化对照;正常人外周血淋巴细胞经SssⅠ甲基化酶处理后再经亚硫酸氢盐修饰作为甲基化对照。阴性对照用水代替模板DNA进行PCR。

1.2.3 RKIP基因甲基化状态检测 用 MSP法。引物设计根据RKIP基因序列，并参照文献［4］的方法合成。RKIP甲基化引物序列:上游引物:5'-TTTAGCGATATTTTTTGAGATACGA-3'，下游引物:5'-GCTCCCTAACCTCTAATTAACCG-3'，扩增片段 204 bp;未甲基化对照引物序列:上游引物:5'-TTTAGTGATATTTTTTGAGATATGA-3';下游引物:5'-CACTCCCTAACCTCTAATTAACCAA-3'，扩 增 片 段205 bp。反应参数:94℃预变性5 min，加入 Taq-DNA 聚合酶后，94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35个循环后，72℃延伸5 min(4℃保存)。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后观察条带。将单纯出现甲基化条带者确定为甲基化;将单纯出现非甲基化条带或同时出现非甲基化条带和甲基化条带者确定为非甲基化。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件，数据分析采用χ2检验。α=0.05。

2 结果

2.1 肺癌、癌旁组织中RKIP基因表达及其启动子区甲基化率比较 RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测见一特异扩增条带，其分子量大小与预期结果相符。肺癌组织中RKIP基因阳性表达率为44.6%(37/83)，明显低于癌旁正常组织中的61.4%(51/83)，P ＜0.05;肺癌组织中 RKIP 基因启动子区甲基化率为45.8%(38/83)，明显高于癌旁组织中的13.3%(11/83)，P ＜0.05。

2.2 RKIP基因表达及其启动子区甲基化率与肺癌临床病理特征的关系 RKIP基因表达及其启动子区甲基化率与肺癌患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、病理分型无关，而与肺癌临床分期、分化程度、淋巴结转移、患者生存时间有关。详见表1。

表1 RKIP基因表达及其启动子区甲基化率与肺癌临床病理特征的关系

3 讨论

RKIP基因定位于人12号染色体q24.22，含4个外显子，编码由187个氨基酸组成的蛋白。RKIP参与对ERK/MAPK、G蛋白偶联受体和NF-κB信号通路的调控［5，6］。研究表明［1，2］，RKIP 在许多肿瘤如胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等组织中表达减少或缺失，但具体机制尚不明确。有学者［4］对82例大肠癌标本检测RKIP启动子区甲基化发现，完全不表达RKIP的肿瘤中，有72.5%显示RKIP启动子甲基化，与RKIP表达减少或缺失一致，认为RKIP启动子中CpG岛甲基化是RKIP沉默的主要机制。

本研究发现，肺癌组织中RKIP基因阳性表达率与癌旁组织比较显著下降，提示RKIP基因表达减少发生在转录水平，其表达缺失与肺癌发生有关。Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移、生存期＜2 a者的肺癌组织中RKIP基因表达阳性率均低于Ⅰ+Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移、生存期≥2 a者，提示RKIP基因表达减少与肺癌的侵袭转移及预后有关。

本研究还发现，肺癌组织中RKIP基因启动子区甲基化频率显著高于癌旁组织。Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移、生存期＜2 a者的肺癌组织中RKIP基因甲基化频率显著高于Ⅰ+Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移、生存期≥2 a者，提示RKIP基因甲基化状态与肺癌的侵袭转移及预后有关。

我们初步认为，肺癌中甲基化的RKIP基因失表达率显著高于该基因未甲基化的癌组织，提示RKIP基因表达缺失与肺癌发生有关，且RKIP发生异常甲基化是其表达缺失的原因。

［1］Wang J，Yang YH，Wang AQ，et al.Immunohistochemical detection of the Raf kinase inhibitor protein in nonneoplastic gastric tissue and gastric cancer tissue［J］.Med Oncol，2010，27(2):219-223.

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