基因组重排构建柔红霉素高产菌株

潘淑勇，刘玉峰，任立华，姚景春，王 成

(鲁南制药集团有限公司，山东 临沂 276006)

临床上盐酸柔红霉素主要用于治疗急性非淋巴细胞性白血病，对儿童白血病有良好的缓解作用。用途更广的是作为合成去甲氧柔红霉素、阿霉素和表柔比星的原料。盐酸柔红霉素及其结构类似物以其广谱、高效的优势难以被其他抗肿瘤药取代。柔红霉素、阿霉素和表柔比星已经作为医保药品惠及我国的癌症患者，但是高昂的生产成本使得药价居高不下。提高柔红霉素的发酵水平、降低生产成本能够从根本上降低药价，对于降低癌症病人的医疗负担和我国的医保费用支出具有非常重要的意义。

本研究应用基因组重排法提高柔红霉素的发酵水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 亲本:F－1:在不含柔红霉素的培养基中生长，发酵效价为 1000 mg·L－1，在含有 500 mg·L－1柔红霉素的培养基中不生长;BX－5:在含有500 mg·L－1柔红霉素的培养基中生长旺盛，但不产生柔红霉素。2种菌株保存在鲁南制药集团科研部。

1.1.2 融合培养基及试剂 TM缓冲液，亚硝基胍(NTG)，无水甲醇AR，生理盐水，25%PEG4000，YEME液体培养基，TSB液体培养基，10.3%蔗糖溶液，2 mg·mL－1溶菌酶溶液，P缓冲液，R5固体平板，500 mg·L－1盐酸柔红霉素水溶液。

1.1.3 色谱条件 高压液相色谱Agilent C18色谱柱(53 mm×7 mm，3 μm);流动相:15 mmol·L－1的磷酸二氢钾 － 乙腈(1∶1);柱温25 ℃;流速1.0 mL·min－1;检测波长:254 nm。

1.1.4 试验仪器 Agilent液相分析仪1100SERIES，日立离心机CF16RX，梅特勒分析天平AB204－S，梅特勒电子天平200 g，梅特勒pH计seven easy，SIM 超低温冰箱F8514，哈东联摇床HZQ－QX，上海博讯全自动电热蒸气压力灭菌器YXQ－LS－75SⅡ，苏州安泰生物安全柜BHC－1300ⅡA/B，天津中环电热恒温水浴锅双列四孔，广东医疗器械厂真菌培养箱LCP－250－MS。

1.2 方法

1.2.1 菌丝体制备 向750 mL三角瓶中分别加入YEME和TSB各125 mL，接种100 μL的孢子悬液，于30℃摇床中培养40 h。将培养物3000 rpm离心10 min，弃上清。

1.2.2 NTG诱变 加入10 mL TM缓冲液，分散均匀，称取10 mg NTG并用10滴甲醇溶解后加入菌丝悬浮液中，于30℃摇床中200 rpm诱变90 min。将菌液离心，弃上清，用生理盐水洗涤3次。

1.2.3 原生质体制备 将菌丝体悬浮于15 mL的10.3%的蔗糖溶液中，3000 rpm离心10 min，弃上清。重复洗两次。取1 mL菌丝体，加入4 mL的溶菌酶溶液，于30℃水浴45 min(每8 min轻轻摇动1次)至上清呈乳状。加入5 mL的P缓冲液，并吹吸几次，继续30℃水浴10 min。用装有脱脂棉的试管过滤，滤液3000 rpm离心7 min。弃上清，用枪将原生质体打散，分装，于－70℃保存。

1.2.4 原生质体融合与再生 将25 μL的F－1原生质体加于已经装有25 μL BX－5原生质体的指型管内。加入200 μL的25%PEG4000，小心抽吸几次使之混匀。将混合物涂布于R5平板上。30℃培养20 h后，用0.5 mL浓度为500 mg·L－1的柔红霉素水溶液覆盖。再培养20 h后，转化子菌落即长出。

1.2.5 遗传稳定性检验 将融合子传代20次后，进行摇瓶培养发酵，用高压液相测定发酵效价，确定其遗传性状的稳定性。

2 结果与分析

2.1 原生质体形成率 本研究采用NTG诱变对F－1和 BX－5进行处理，扩大了基因组重排的出发菌株的遗传差异性。将制备的原生质体镜检并计算原生质体生成率(见表1)。

表1 原生质体形成率

2.2 原生质体再生率测定 将2种原生质体分别涂布于R5平板上。30℃培养20 h后，计算菌落数。酶解前的菌液用无菌水稀释后涂布于R5平板上。30℃培养20 h后，计算菌落数。比较得出每种菌的原生质体再生率(见表2)。

表2 原生质体再生率

2.3 融合子的检出和初筛 当单菌落长出，并且菌落周围出现深红色色斑者，即确定为融合子。挑选色斑最大的前10个融合子，编号为CP－1至CP－10，进行摇瓶发酵试验，培养156、168、180 h，用高压液相测定效价，结果见表3。

2.4 融合子的稳定性试验 选择效价最高的2个融合子:CP－1和CP－7，传代20次后，进行摇瓶培养发酵，用高压液相测定发酵效价，测定结果见表4。

表3 发酵效价初筛结果

菌号 时间(h) 效价(mg·L－1)CP－3156 865168 908180 756 CP－4156 892168 1008180 824 CP－5156 468168 582180 507 CP－6156 213168 357180 190 CP－7156 1509168 1598180 1483 CP－8156 112168 405180 250 CP－9156 782168 865180 815 CP－10156 801168 1001180 953

表4 发酵效价稳定性试验结果

结果证明融合子CP－1和CP－7遗传稳定性都很好。

3 小结

我们采用NTG诱变方法扩大了基因组重排出发菌株的遗传差异性，原生质体融合操作简单，效果明显。基因组重排法能够使柔红霉素发酵效价提高50%，有必要在工业育种领域大力推广。