烧伤膏对烫伤小鼠皮肤细胞自由基代谢和DNA损伤的影响

刘颖 陈镇 葛朝亮 夏泉 许杜娟

(安徽医科大学第一附属医院药剂科，安徽 合肥 230022)

在前期研究[1]中，我们成功地建立了浅Ⅱ度烫伤创面的烫伤小鼠模型，观察了烧伤膏对创面皮肤愈合时间与愈合率和皮肤组织形态的修复情况，结果证明烫伤小鼠经烧伤膏治疗15 d后能明显缩短皮肤创面愈合的时间，提高愈合率，并能显著改善创面皮肤病理形态的恢复。但烫伤皮肤组织细胞有无自由基爆发？细胞中DNA有无损伤？烧伤膏修复烫伤皮肤组织细胞的作用机制是什么？本实验拟通过检测烫伤小鼠组织中的超氧自由基浓度和相关抗氧化酶活性和DNA慧星拖尾长度等实验指标，揭示烧伤膏治疗烫伤皮肤的部分作用机制。

1 材枓与方法

1.1 药品与试剂

烧伤膏由我科制剂研究室制备，批号20101124；超氧化物歧化酶（SOD），超氧阴离子（·O2－）、羟自由基（·OH）及过氧化氢（H2O2）测定试剂盒等均为南京建成生物工程研究所产品；四乙氧基丙烷（TEP)，瑞士Fluka产品；正常熔点琼脂糖（NMPA）和低熔点琼脂糖（LMPA），均为Pharmacia公司产品，溴化乙锭，AMRESCO公司产品，十二烷基肌氨酸钠，二甲基亚砜，三羟甲基氨基甲烷，Triton-100，均为Sigma公司产品，其余试剂均为市售国产分析纯。

1.2 动物

昆明种健康小鼠，雌雄各半，体重18～ 22 g，由安徽医科大学动物实验中心提供，合格证号为皖医动准字01号。

1.3 仪器

HH-W600数显恒温水浴箱（金坛市精达仪器制造厂）；HG-101-5电热鼓风干燥箱（南京实验仪器厂）；DYCP-38BA电泳槽和DYY-11B三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂）；TDL-16C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；BX41荧光显微镜和显微镜成像系统（日本Olympus公司）；721分光光度计（上海第三仪器厂）。

1.4 小鼠皮肤烫伤模型的建立与实验分组

按我们建立的烫伤小鼠模型方法[1]，取小鼠50只，随机分为5组，每组10只。即①正常对照组，②烫伤模型组，③、④、⑤为烧伤膏高、中、低剂量组。①组和②组小鼠每日均于背部脱毛区涂抹烧伤膏基质麻油1 g；③～⑤组小鼠每日均于背部脱毛区涂抹烧伤膏1 g，相应的剂量分别为13.4、26.8及53.6 g/kg，早晚各1次，连续给药15 d。

1.5 抗氧化酶活性和自由基浓度的测定[2]

于末次给药后2 h，拉颈处死小鼠，小心取下创面皮肤（尽量剥尽皮下脂肪），精密称取2 g左右，在冰浴中加入预冷的生理盐水制成10%的细胞悬液，4 000 r/min离心5～10 min，取上清，用于测定各项指标。检测严格按照试剂盒说明书进行：SOD采用黄嘌呤氧化酶法，LPO采用硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法，以代谢产物丙二醛（MDA）为计量单位，H2O2采用化学比色法，·OH采用发光比色的方法测定含量。·O2－自由基采用模拟黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶反应系统，产生·O2－，用化学比色法测定含量。皮肤细胞中蛋白用Lorry法测定。单位以每mg中的摩尔浓度或国际单位表示。

1.6 DNA慧星实验

于末次给药后2 h，拉颈处死小鼠，细心取下创面皮肤（尽量剥尽皮下脂肪），精密称取2 g左右，在冰浴中加入4℃预冷的适量无Ca2+、Mg2+的PBS，用手术剪反复剪成1～3 mm3米粒状，然后加入0.3%胶原酶（pH 6.5)。置36.5℃水浴中消化2 h，其间不断振摇，用200 μm铜网筛过滤，然后1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀物用PBS制成细胞悬浮液，用计数板计数。用台盼蓝染色法测定细胞存活率并调整细胞浓度为103～105/mL置于冰浴中备用。按文献方法[3]进行电泳，结果在荧光显微镜（610 nm激发波长)下观察。每个剂量组拍摄100个细胞，计数其中的拖尾细胞数，计算凋亡慧星拖尾百分率。采用Image-Pro Plus 6.0软件测量慧星头长和全长，由此计算慧星尾长。计算公式：慧星尾长（μm）=慧星全长－慧星头长。

1.7 统计学处理

所有数据均使用SPSS13.0进行统计学分析，检测所得数据均用±s表示，各组间用单因素方差分析比较，以P＜0.05为差异有统计意义，以P＜0.01为差异有高度统计意义。

2 结果

2.1 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤组织中超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢生成的影响

由表1可以看出，烫伤模型组小鼠皮肤组织中的超氧·O2－、·OH以及氧自由基的代谢产物H2O2的含量都明显高于正常组，差异十分显著（P均＜0.01），表明皮肤组织烫伤后可以诱发皮肤细胞中自由基浓度异常升高。当烫伤小鼠连续外涂烧伤膏15 d后，发现烧伤膏低、中、高剂量组均能明显降低皮肤细胞中自由基的含量（P均＜0.01），揭示烧伤膏具有抑制或减少烫伤皮肤细胞中自由基生成的作用。

2.2 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤组织中SOD活性和LPO浓度的影响

正常组皮肤细胞中SOD活性为（225.31±14.52）U/mg，模型组皮肤细胞中SOD活性为（32.54±5.48）U/mg，两者差异有高度统计意义（P＜ 0.01）。正常组皮肤细胞中MDA浓度为（1.28± 0.47）nmol/L，远低于模型组皮肤细胞MDA（10.65± 2.35）nmol/L，表明皮肤在烫伤后细胞膜脂质过氧化产物MDA浓度大量升高（P＜0.01）。当烫伤小鼠连续外涂烧伤膏15 d后，发现药物组的低、中、高剂量组皮肤细胞中的SOD活性升高明显，而MDA浓度则随着剂量的加大而相应降低，其中以高剂量组效果最佳（P均＜0.01）。提示烧伤膏有明显地提高SOD活性和减少皮肤细胞膜脂质过氧化物生成的作用(见表2)。

表1 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤组织细胞中自由基浓度的影响（±s,n=10）

表1 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤组织细胞中自由基浓度的影响（±s,n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，下同

组别 剂量（g/kg）·O2－(U/g prot)·OH(U/mg prot)H2O2(mmol/L)正常组 - 125.01±6.58** 19.25±1.38** 25.52±3.54**模型组 - 279.35±13.44 85.04±5.36 120.57±8.65烧伤膏组 13.4 247.06±9.17* 50.27±2.71** 76.14±4.21**26.8 206.47±8.34** 44.14±2.57** 50.49±3.75**53.6 186.45±7.52** 36.88±1.68** 40.05±2.25**

表2 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤组织细胞中SOD和LPO的影响（±s,n=10）

表2 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤组织细胞中SOD和LPO的影响（±s,n=10）

组别 剂量（g/kg）SOD(U/mg prot)MDA(nmol/L)正常组 - 225.31±14.52** 1.28±0.47**模型组 - 32.54±5.48 10.65±2.35烧伤膏组 13.4 45.47±6.84* 5.34±0.50**26.8 142.08±10.52** 3.45±0.81**53.6 174.66±12.75** 2.57±0.72**

2.3 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤细胞慧星细胞百分率和慧星尾长的影响

从表3可看出，烫伤模型组小鼠皮肤组织细胞中慧星拖尾细胞百分率高达97%，大大超过正常组，同时慧星细胞尾长也显著增加，与正常对照组对比，差异有高度统计意义(P＜0.01)，说明丝裂霉素（MMC）能造成小鼠骨髓淋巴细胞DNA损伤。而预先外涂烧伤膏15 d后，与模型组小鼠比较，可发现烧伤膏三个剂量组小鼠骨髓淋巴细胞中含有DNA慧星细胞数量和拖尾长度均显著减少 (P均＜0.01)，且呈明显的量效关系，提示烧伤膏对MMC诱发的小鼠骨髓细胞DNA损伤具有明显的拮抗作用 (见表3及图 1)。

表3 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤细胞慧星细胞百分率和慧星尾长的影响（±s，n=10）

表3 烧伤膏对烫伤小鼠皮肤细胞慧星细胞百分率和慧星尾长的影响（±s，n=10）

组别 剂量（g/kg）观察细胞数 拖尾细胞 尾长(μm)数量正常组 - 100 3 3.0 16.12±2.45**模型组 - 100 97 97.0 165.14±7.06 13.4 100 75 75.0 106.27±5.41**26.8 100 61 61.0 58.01±3.45**53.6 100 42 42.0 35.44±3.22**百分率（%）烧伤膏组

图1 烫伤小鼠皮肤细胞DNA慧星电泳及烧伤膏的治疗作用

3 讨论

自由基学说是由美国科学家Harman在1955年首次提出的，他认为在机体有氧代谢中会产生少量的·O2－，·OH和H2O2等自由基，在正常生理情况下，它们很快被体内抗氧化酶系统（如SOD、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX））或外源性抗氧化剂（如维生素 E和维生素C等）迅速清除，通常不会对机体细胞产生毒害。但在各种致病因素如感染、发热、应激、环境毒物接触、辐射、污染等存在的情况下，能够造成体内抗氧化酶活性显著下降，而大量自由基的生成无法得到及时清除，后者就会迅速攻击细胞膜，并引起细胞膜脂质过氧化，造成细胞膜这一生物屏障破坏而影响细胞新陈代谢，有害的自由基进而破坏胞内生物大分子如核酸、蛋白质、酶、糖类等，使DNA链断裂、蛋白质交联变性、糖链断裂、酶失活和信号通路障碍，最终诱发细胞死亡，诱发机体产生肿瘤、衰老和发生各种疾病[2,4]。我们认为，当皮肤受到烧伤烫伤后，首先立即引起细胞生物结构破坏或变性，继而细胞内在热刺激下皮肤表皮和真皮细胞中产生大量的氧自由基，而抗氧化酶系统由于自身功能受损而无法清除过度激增的自由基，因而破坏细胞膜结构，降解细胞内生物大分子，同时引起细胞产生大量的炎症因子，血管通透性增大，局部组织水肿，形成继发性感染，因此抗菌消炎为首选[5-9]。我们的实验证实，与正常对照组比较，烫伤小鼠皮肤细胞中SOD活性显著下降，而膜脂质过氧化产物MDA和·O2－、·OH、H2O2等自由基的浓度却相应地异常升高，使DNA多聚核苷酸链与碱基对发生断裂，因而DNA慧星拖尾长度显著加长，提示皮肤烫伤后，皮肤正常屏障遭到破坏，会诱发自由基代谢紊乱、抗氧化能力下降以及DNA出现断裂。当连续给烫伤小鼠外涂烧伤膏15天后，发现烧伤膏可以增强烫伤小鼠皮肤细胞中的SOD活力，使·O2－、·OH、H2O2等自由基生成显著减少，可以使细胞中的DNA免受自由基的攻击，由此可见，烧伤膏治疗皮肤烫伤的良好疗效可能与提高机体抗氧化能力、清除自由基及保护DNA的作用机制有关。

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