H1亚型猪流感病毒HA基因密码子优化的DNA疫苗免疫保护效力研究

杨馥如，于 海，王 斌，黄 梦，马继红，周艳君，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

H1亚型猪流感(swine influenza, SI)是由隶属于正粘病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒( Swine influenza virus, SIV)引起的猪呼吸道疾病，是目前危害全世界养猪业的重要呼吸道疾病之一[1]。1930年，Shope等[2]首次分离到SIV，后经研究证实，该毒株属于经典H1N1亚型SIV。回顾历史上的大型流感爆发，经典H1N1亚型SIV曾在加拿大、巴西、香港、日本、印度、中国、肯尼亚、伊朗等各地被广泛报道[3]。1977年爆发的“俄国流感”也是由H1N1亚型流感病毒引起[4]。1998年以前，H1N1亚型SIV一直是北美猪群中流感病毒的优势毒株。欧洲大陆自1979年起开始广泛流行经典H1N1亚型SIV，血清阳性率达到20%～25%[5]。2009年，墨西哥和北美爆发了甲型H1N1流感，并迅速在世界范围内引发人类流感大流行。因此H1亚型SI作为一种具有严重危害的流行性疾病，对其进行研究具有重要的经济和公共卫生学意义。

接种疫苗是预防流感发生与传播的最有效方式，其中DNA疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫而产生长期保护效果, 并且具有高度的安全稳定性。目前猪流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)的DNA 疫苗的研究已经取得了一定的进展[6,7]，但是DNA疫苗存在体内抗原表达量低的缺点，因此，提高DNA疫苗的免疫原性已成为基因免疫的热点。对免疫原基因进行密码子优化，使其为哺乳动物体内偏嗜性密码子，可导致mRNA中CG含量的大幅度提高，从而增加mRNA的稳定性，最终可使蛋白表达量大大提高。密码子优化成功的例子已有很多报道[8-11]。本研究对 H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)HA基因密码子进行优化，与野生型A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)HA基因分别构建免疫质粒，并通过免疫小鼠评价疫苗的免疫原性和保护效力，为进一步研究和开发H1亚型猪流感病毒的HA基因DNA疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株、细胞与载体 猪流感病毒毒株A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)由本实验室分离鉴定保存；质粒转化受体菌E.coliDH5α和PCAGGS原核表达载体为本实验室保存。

1.1.2 主 要 试 剂 ExTaq DNA聚 合 酶、SmalⅠ和XhoⅠ 限 制 性 内 切 酶、RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase、dNTPs和 T4 DNA连接酶购自宝生物工程有限公司；预染蛋白Marker购自NEB公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程公司；脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；DMEM细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗鼠二抗购自中杉金桥公司；鼠抗A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)阳性血清由本实验室制备保存；细胞因子(IL-4 和IFN-γ)检测试剂盒购自R&D Systems公司；RNA提取试剂盒购于Qiagen公司；其他普通生化试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 实验动物 9～11日龄SPF鸡胚由山东省农业科学院家禽研究所提供；6～8周龄雌性BALB/c小鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1HA基因密码子优化 将A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)的HA基因全部密码子按猪体所偏嗜的密码子进行优化，并在该基因上引入SmalⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切位点，命名为optiHA，基因的优化及改造由英骏生物技术有限公司完成。

1.2.2HA基因的扩增和重组质粒的构建 将A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)野生型HA基因和optiHA基因分别进行PCR扩增，经SmalⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样酶切处理的载体PCAGGS连接，经酶切、测序鉴定后得到的重组质粒分别命名为PCAGGS-HA和PCAGGS-optiHA。

1.2.3 间接免疫荧光检测重组质粒的体外表达 将4 μg重组质粒PCAGGS-HA和PCAGGS-optiHA分别在LipofectamineTM2000的介导下，体外转染生长状态良好的293T 细胞，以空载体PCAGGS为对照。48 h后弃掉细胞培养液，用预冷的1×PBS重悬细胞后离心，重复2次。最后1次重悬的细胞铺于载玻片上，自然干燥后用预冷的丙酮溶液4℃固定30min，加入鼠抗A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)阳性血清(1:500稀释)，37℃作用1 h。用预冷的1×PBS洗3遍,加入荧光素标记的羊抗鼠二抗（1:10 000稀释），37℃作用1 h。同样用预冷的1×PBS洗3遍后，加20 μL甘油并盖盖玻片，于荧光显微镜下观察。

1.2.4 免疫BALB/c 小鼠及攻毒试验 选取6～8 周龄健康雌性BALB/c 小鼠30只，随机分为3 组。重组质粒PCAGGS-HA、PCAGGS-optiHA以及对照空载体pCAGGS分别以100 μg多点注射后腿肌肉。共免疫3 次，每次间隔3 周。在第1次免疫后第2、4、6 、8 周采血，分离血清用于检测抗体。在3免后2周，通过滴鼻方式对每只小鼠感染50 μL 103.87EID50的A/Swine/A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)，攻毒后3 d安乐处死小鼠，取其肺部组织研磨，进行病毒的分离和滴定。

1.2.5 抗HA 特异性抗体和HI 抗体检测 用终点稀释间接ELISA 方法检测抗HA 特异性抗体[12]。包被抗原用纯化的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)，封闭用5 %的脱脂乳，待检血清用PBS 从100倍起做倍比稀释，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠的IgG以 1:10 000稀释，底物缓冲液避光显色5 min， 2 mol/L H2SO4 终止反应后， 酶标仪测定OD450值。样品血清的OD 值是对照血清的2 倍以上判为阳性。将每组收集的第8周血清用于检测HI 抗体[13]。

1.2.6 细胞因子(IL-4 和IFN-γ)的检测 IL-4 和IFN-γ的检测按试剂盒说明书进行。每孔先加50 μL的Assay diluent，再分别加入50 μL 标准、对照和已做3倍稀释的第8 周血清，37 ℃孵育2 h；洗板4 次，加入Conjugate工作液，37 ℃孵育2 h；洗板4次，加入100 μL Substrate solution工作液， 37 ℃避光孵育30 min，再加入100 μL Stop Solution，酶标仪测定OD450值。

1.2.7 攻毒后肺病毒含量测定 在攻毒后d 3 安乐处死小鼠，取其肺部组织进行研磨，采用鸡胚滴定EID50检测肺脏中的病毒滴度。取组织匀浆上清进行10倍倍比稀释，每个稀释度接种5枚9～11日龄的SPF鸡胚，37℃孵育48 h，通过血凝试验判断尿囊液中是否含有病毒。利用Reed-Muench法[14]计算肺脏中的病毒滴度，结果以log10EID50/mL±S.D表示。

2 结果

2.1 重组质粒的构建与鉴定 A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)野生型HA基因和optiHA基因经PCR扩增，分别与载体PCAGGS连接，经SmalⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定，获得的片段大小约为1800 bp，同预期结果一致 (见图1) 。

图1 重组质粒的构建与鉴定Fig.1 Construction and identif i cation of the recombinant expression plasmid

2.2 间接免疫荧光检测 将重组质粒PCAGGSHA、PCAGGS-optiHA和PCAGGS分别转染293T细胞，48 h后收细胞并重悬，制细胞涂片，于荧光显微镜下观察。结果显示，经PCAGGS-optiHA转染产生荧光的细胞数明显多于PCAGGS-HA转染产生荧光的细胞数，而空载体PCAGGS转染未产生有荧光的细胞 (见图2) 。

图2 PCAGGS-HA、PCAGGS-optiHA和PCAGGS在293T 细胞上的表达（×400）Fig.2 Expression in the 293T cells of PCAGGS-HA、PCAGGS-optiHA and PCAGGS(×400)

2.3抗HA 特异性抗体和HI抗体的检测 用ELISA检测抗HA 特异性抗体，结果显示在一免后2周免疫组PCAGGS-optiHA和PCAGGS-HA都产生了抗体，抗体水平相对不高并且差异没有统计学意义，同时对照PCAGGS组没有明显的抗体产生。一免后的4、6、8周免疫组PCAGGS-optiHA的抗HA特异性抗体都明显高于免疫组PCAGGS-HA，同时对照PCAGGS组一直未检测到明显的抗体产生（见图3）。将每组收集的第8 周血清通过血凝抑制实验检测HI 抗体，结果表明免疫组PCAGGS-optiHA和PCAGGS-HA都可以检测到抗体，而对照组PCAGGS基本检测不到抗体，并且免疫组PCAGGS-optiHA的抗体效价要明显高于免疫组PCAGGS-HA（P＜0.001，见表1）。

图3 小鼠血清中抗HA特异性抗体的ELISA 检测Fig.3 ELISA detection for anti-HA antibody in mice after inoculation of various plasmids

表1 小鼠血清中HI抗体检测（P＜0.001）Table 1 HI antibody detection in mice after inoculation of various plasmids(P＜0.001)

2.4 细胞因子(IL-4和IFN-γ)的检测 将首免后第8周的各组血清按照试剂盒的说明进行细胞因子检测。结果显示，质粒PCAGGS-optiHA诱导了高水平的IL-4，而质粒PCAGGS-HA诱导了较低水平的IL-4（P＜0.01，见图5）。结果表明，质粒PCAGGS-optiHA显著地增强了IL-4 的产生，并诱导了高水平的体液免疫应答。而在检测IFN-γ的实验中，相对于质粒PCAGGS-HA，质粒PCAGGS-optiHA诱导产生了较高水平的IFN-γ（P＜0.05，见图5）。结果表明，质粒PCAGGS-optiHA显著地增强了IFN-γ的产生，并能诱导较高水平的细胞免疫应答。

图5 细胞因子IL-4和IFN-γ 的检测Fig.5 Level of IL-4 and IFN-γ from serum in the immunized mice

2.5 肺组织病毒含量检测 在攻毒3 d后安乐处死小鼠，取其肺部组织进行研磨，取上清按 VI法测定病毒含量，并利用Reed-Muench法[14]计算肺脏中的病毒滴度，结果以log10EID50/mL表示，当值小于1则表明检测不到病毒。结果显示，免疫组PCAGGS-HA小鼠肺脏中仅检测到少量的病毒，免疫组PCAGGS-optiHA检测不到病毒，而对照组PCAGGS小鼠肺中检测到大量的病毒。可见，免疫组PCAGGS-optiHA可有效阻止病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)在小鼠肺脏的复制。经统计学分析，免疫组与对照组小鼠肺脏病毒滴度差异具有显著统计学意义（P< 0.01，见图6）。

图6 攻毒后d3小鼠肺脏中病毒滴度（P ＜ 0.01）Fig.6 Virus titers in lungs on day 3 after challenge(P ＜ 0.01)

3 讨论

DNA疫苗的抗原表达水平对其免疫原性和保护效力起着十分关键的作用[15]，猪流感DNA疫苗的研制方法主要通过将猪流感病毒的免疫原HA或NA等基因单独或与细胞因子编码基因串联到真核表达质粒中，然后再将重组的质粒DNA注入到机体内，从而诱导机体产生特异性免疫应答而发挥作用。Wong等[16]用脂质体pCI作为载体来表达A/PR/8/34毒株的HA基因作为DNA疫苗。Ljungberg等[17]用2株在遗传学和血清学不同的A型流感毒株(pKCMV HA A/Stockholm/7/97 and pKCMV HA A/NL/18/94)构建嵌合HA质粒DNA疫苗。胡永浩等[18]应用已构建的真核表达质粒pCI-H1-HA、pCAGGS-H1-HA、pCI-H3-HA和pCAGGS-H3-HA作 为DNA疫苗，经动物实验证明都可诱导产生抗体滴度[19]，但是DNA疫苗存在多次免疫才能诱导有效的免疫应答，并且对大动物免疫效力低下等问题[20]。有研究表明，用经过密码子优化的DNA疫苗接种模型动物，所诱导的免疫应答会显著提高。王俊国等[21]对H5亚型禽流感病毒A/Duck/Anhui/1/2006 (Clade 2.3)HA基因密码子进行优化，可以产生较强的免疫保护效力。侯艳红等[22]研究的PRRSVGP5密码子优化的基因DNA疫苗在小鼠体内产生了较强的免疫应答。因此，本研究将H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)的HA基因的密码子优化为猪体内偏嗜性密码子optiHA，同野生型A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)的HA基因分别与真核表达载体PCAGGS相连构成重组质粒PCAGGS-optiHA和PCAGGS-HA。用间接免疫荧光技术检测HA基因的体外表达时发现，PCAGGS-optiHA转染产生荧光的细胞数明显多于PCAGGS-HA转染产生荧光的细胞数，这表明密码子优化的HA基因的蛋白表达水平要高于野生型的HA基因。免疫小鼠后，用ELISA检测抗HA特异性抗体和血凝抑制检测HI抗体，发现在首免第2周后，PCAGGS-optiHA免疫组诱导产生的HA特异性抗体和HI抗体滴度明显高于PCAGGS-HA免疫组，这表明密码子优化的HA基因DNA疫苗的免疫原性要明显高于野生型的HA基因DNA疫苗。细胞因子IL-4检测实验发现，两免疫组都显著高于对照组，这说明DNA免疫质粒确实在一定程度上激活了机体的体液免疫应答。同时，相对于PCAGGS-HA免疫组，PCAGGS-optiHA免疫组可诱导产生高水平的IL-4，说明免疫原基因密码子优化后诱发了较强的体液免疫应答。细胞因子ILN-γ检测实验发现，虽然各组的值相对于IL-4的值较低，但同对照组相比，免疫组明显可诱导产生比较高水平的ILN-γ，这一结论同细胞因子IL-4检测相一致。攻毒实验结果显示，免疫组PCAGGSHA的肺组织病毒含量相对于空载体PCAGGS组有明显降低，而免疫组PCAGGS-optiHA检测不到病毒，这表明密码子优化的DNA疫苗可有效阻止病毒在小鼠肺脏的复制。

本研究结果表明，HA基因密码子的优化可显著提高DNA疫苗的免疫原性，并且可增强诱导保护性体液免疫和细胞免疫应答水平，这一结论为研究高效、安全新型的猪流感基因工程疫苗奠定了基础。

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