Ipr1对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染免疫相关基因表达的影响*

李 娜,刘鹏飞,李波清,乔媛媛,张玉梅

2.滨州医学院附属医院神经外科,烟台 264003

Ipr1对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染免疫相关基因表达的影响*

李 娜1,刘鹏飞2,李波清1,乔媛媛1,张玉梅1

目的应用基因芯片技术检测Ipr1的表达对巨噬细胞感染分枝杆菌H37Ra后参与免疫应答的相关基因的表达差异。方法实验组与对照组细胞分别感染分枝杆菌H37Ra,基因芯片检测实验组和对照组细胞感染H37Ra 96h后免疫相关基因表达差异。定量PCR反应检测芯片结果中上调的3个基因的表达差异用以验证芯片结果的可靠性。结果基因芯片检测结果显示Ipr1基因的表达上调了11个固有免疫机制中相关基因表达,其中与MΦ抗Mtb感染关系密切的基因有:TLR2、TLR4、Irak1、Traf6、Ifngr1、Tnfrsf1a,而参与调节适应性免疫应答的相关基因如:IL-1,IL-12无明显表达差异。结论

Ipr1增强MΦ抗Mtb感染的机制可能主要是通过上调MΦ抗感染固有免疫机制的有关基因的表达从而发挥抗菌作用。本实验为进一步研究Ipr1促进MΦ的活化及杀伤胞内吞噬的Mtb的作用机制奠定了基础。

Ipr1;结核分枝杆菌;巨噬细胞

结核病是严重威胁人类健康的疾病,全球每年约有800万新发病例,170多万人死亡,死亡数居单一传染病之首[1]。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)为细胞内寄生菌。越来越多的研究表明固有免疫应答在抗结核分枝杆菌感染中发挥着重要的作用。而巨噬细胞(MΦ)是固有免疫应答中最主要的细胞,它是机体抗Mtb感染的第一道防线[2-3],2005年,Pan等在小鼠MΦ内发现了一个介导MΦ抗胞内病原体的基因—胞内病原体抗性基因1(intracellular pathogen resistance 1,Ipr1),该基因具有体外调节MΦ对Mtb反应能力的作用[4]。

本实验室已成功构建Ipr1基因真核表达基因pEGFP-Ipr1并且验证Ipr1基因产物表达部位位于细胞核内[5]。在本研究中将利用基因芯片技术研究Ipr1基因的表达与M Φ抗分枝杆菌感染固有免疫相关机制之间是否有着某种相互关联,从而为阐明Ipr1在MΦ抗结核病固有免疫中的机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞和菌株 质粒pEGFP-Ipr1由本实验室构建保存,质粒pEGFP-C1、细胞株RAW264.3由本实验室保存。分枝杆菌减毒株H37Ra为北京药品生物制品检定所提供(菌号93020)。

1.2 主要试剂 RPMI1640培养基干粉、1∶125胰蛋白酶(美国Gibco公司);6孔细胞培养板、24孔细胞培养板(美国Costar公司);胎牛血清(杭州四季青公司);真核细胞转染试剂 Lipofectamine2000(Invitrogen公司);M7H9培养基干粉、M7H10培养基干粉及OADC enrichment(Difco公司)。美国SuperArray公司的小鼠固有免疫和适应性免疫应答基因芯片(Oligo Innate&Adaptive Immune Responses Microarray)购自上海康成公司。

1.3 稳定表达 Ipr1的 RAW264.7筛选RAW264.7细胞分别转染pEGFP-Ipr1及空质粒pEGFP-C1,G418筛选稳定表达Ipr1的RAW264.7细胞及稳定表达绿色荧光蛋白的 RAW264.7细胞[6],分别命名为实验组及对照组。

1.4 结核分枝杆菌H37Ra的培养及细菌悬液的准备 挑取改良罗氏培养基上处于对数生长期的新鲜分枝杆菌H37Ra菌落,以0.05%吐温盐水充分研磨后,接种M7H9液体培养基,37℃静止培养约3 w后,密闭离心弃上清,以高压灭菌的0.9%生理盐水反复淘洗后自然沉淀3次,每次10min,取上清,无血清RPMI1640培养液重新调整细菌浓度为1×107/mL制成细菌悬液备用。

1.5 分枝杆菌H37Ra感染巨噬细胞及细胞吞噬细菌量检查 经G418筛选得到的实验组细胞与对照组细胞常规用含10%胎牛血清、600μ g/mL G418的RPMI 1 640培养液在 5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养。待细胞状态良好,将实验组细胞和对照组细胞分别用0.25%的胰蛋白酶消化并收获细胞,转种至6孔板,每孔细胞数为1×106,同时常规制备6孔板细胞爬片用于抗酸染色。继续用含10%胎牛血清、600μ g/mL G418的 RPMI1640培养基培养,待细胞贴壁换用无G418、无抗生素的含10%胎牛血清 RPMI1640培养基培养细胞,同时加入PMA,使其终浓度为 100nmol/L。24h后,将前述准备的分枝杆菌H37Ra细菌悬液按细胞∶细菌=1∶10的比例加入到6孔板的实验组和对照组细胞培养孔内,5%CO2、37℃培养6h,用含1%胎牛血清的PBS洗涤3次,洗去未被MΦ吞噬的细菌,换入新鲜的不含抗生素的完全RPMI1640继续培养(为便于描述将此时间点计为0h)。之后每隔6h将细胞用含1%胎牛血清的PBS洗涤3次,换入新鲜不含抗生素的完全RPMI1640继续培养。24h后将细胞常规洗涤3次取出实验组和对照组细胞爬片进行抗酸染色观察MΦ吞噬细菌情况。

1.6 基因芯片检测 细菌感染96h后,抽提6孔板中各组细胞总RNA。提取的的总RNA标本经琼脂糖凝胶电泳检测完整性及紫外分光光度计检测OD值以确定其纯度及浓度。按相关试剂盒说明进行cDNA的合成及线性生物素标记的cRNA的合成、扩增及纯化。按Oligo Innate&Adaptive Immune Responses Microarray基因芯片检测说明书进行芯片杂交。应用化学发光检测试剂盒检测芯片杂交结果。X射线胶片曝光在胶片上显示检测结果。X-射线胶片曝光后,将胶片上的图象用Microtek 120TF扫描仪(上海中晶)扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。使用配套软件GEArray Expression Analysis Suite对原始数据进行完整的芯片数据分析。计算待检基因表达水平占该看家基因表达水平的百分率然后比较对照组及实验组特定基因表达水平的差异。

1.7 Real-time PCR检测 为验证芯片检测结果的可靠性选取上述基因芯片检测结果中上调的3个基因进行Real-time PCR检测。应用引物设计软件Primer 5,分别设计了3个待检基因及内参GAPDH的上下游引物:GAPDH F 5′AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC 3′R 5′TCCACCACCCTGT TGCTGTA 3′;Ifngr1 F 5′CT TTGACGAGCACTGAGGA 3′R 5′CCAGGAACCCGAATACACC 3′;Tlr2 F 5′TGTCGT TCAAGGAGGTGCG 3′R 5′TCCAGAAGAGCCAAAGAGC 3′;Tlr4 F 5′GAGAATCTGGTGGCTGTGG 3′R 5′T TCCCTGAAAGGCT TGGTC 3′。采用上述方法进行细菌培养及感染细胞,RNA抽提及 RT-PCR合成cDNA方法同基因芯片检测。制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板:针对每一需要测量的基因和管家基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应,PCR产物与100 bp DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释,设定PCR产物浓度为1,分别稀释为1×10-1,1×10-2,1×10-3,1×10-4,1×10-5,1×10-6,1×10-7这几个梯度浓度的DNA。几个梯度稀释的DNA模板以及所有GAPDH 、Ifngr1、Tlr2 、T lr4 cDNA 样品分别配置 Realtime PCR反应体系进行PCR反应,分别在86℃、85℃、81℃、85℃收集荧光。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线,各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为此样品此基因的校正后的相对含量。

2 结 果

2.1 稳定表达 Ipr1的 RAW264.7筛选 转染pEGFP-Ipr1质粒的RAW264.7细胞经G418压力筛选6W,获得具有抗性的阳性克隆,经RT-PCR鉴定正确即为稳定表达Ipr1的细胞(实验组),倒置荧光显微镜下观察可见荧光集中在细胞核内见图1-1。空质粒 pEGFP-C1转染 RAW264.7细胞经G418筛选6W倒置荧光显微镜观察可见荧光表达于整个细胞(对照组),见图1-2。

图1.1 荧光显微镜观察G418筛选6w的转染pEGFP-Ipr1的 RAW264.7细胞 ×250图1.2 荧光显微镜观察G418筛选6w的转染pEGFP-C1的 RAW264.7细胞 ×250Fig.1.1 6w after teansfection of RAW264.7 cellswith pEGFP-Ipr1×250Fig.1.2 6w after teansfection of RAW264.7 cellswith pEGFP-C1×250

2.2 分枝杆菌H37Ra细胞感染 实验组细胞和对照组细胞在感染H37Ra 24h后,抗酸染色观察可见约70%的细胞至少吞噬了1个抗酸菌,平均每个细胞吞噬20个左右的抗酸菌,表明H37Ra成功感染了实验组和对照组RAW264.7,见图2.1,2.2。

图2.1 实验组RAW264.7感染 H37Ra 24h;抗酸染色×1000图2.2 对照组RAW264.7感染H37Ra 24h;抗酸染色×1000Fig.2.1 The experimental group RAW264.7 cells infected with H37Ra for 24h×1000Fig.2.2 The control group RAW264.7 cells infected with H37Ra for 24h×1000

2.3 总RNA的抽提及质量检测 实验组和对照组细胞抽提的总RNA,经琼脂糖凝胶电泳观察总RNA的28s和18s rRNA带型清晰且28s亮度是18s亮度的2倍以上,表明总RNA较完整,见图3。经紫外吸收测定OD值,实验组标本和对照组标本的OD260/OD280值分别为2和1.98,表明提取的总RNA纯度较高,可以用于后续实验。实验组标本和对照组标本总RNA浓度分别是1 765.56 ng/μ L和 1 486.74 ng/μ L。

2.4 基因芯片杂交化学发光检测结果 实验组标本和对照组标本所得的线性生物素标记的cRNA与小鼠Oligo Innate&Adaptive Immune Responses Microarray芯片杂交后,经化学发光检测,X-胶片成像结果见图4-1、4-2。

图3 实验组与对照组RAW264.7细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Result of the experimental group cells and the control group cells total RNA

经GEArray Expression Analysis Suite软件对原始数据进行完整的芯片数据分析,比较实验组及对照组特定基因表达水平的差异。分析结果发现实验组较对照组有11个基因表达上调大于2倍,其中包括T LRs及其信号通路的基因:TLR2、T LR4、Irak1、Traf6;干扰素γ受体相关基因:Ifngr1(IFN-γ R1);肿瘤坏死因子受体相关基因:Tnfrsf1a(TNFR1);细胞识别及细胞间相互作用相关基因:Lbp、Fcgr1、Colec12;炎症反应相关的基因:Cebpe、T rem1。这些基因表达上调主要表现为调节MΦ固有免疫应答能力,而与MΦ调节T淋巴细胞的适应性免疫应答相关的一些细胞因子如 IL-1、IL-12、TNF-α等的表达却无明显差异。表1列出实验组比对照组表达上调2倍以上的基因。

图4-1 实验组细胞感染H37Ra 96h后cDNA基因芯片检测结果图4-2 对照组细胞感染H37Ra 96h后cDNA基因芯片检测结果Fig.4-1 cDNA expression array result of the experimental group cells infected with H37Ra for 96 hFig.4-2 cDNA expression array result of the control groupcells infected with H37Ra for 96 h

表1 实验组比对照组表达上调2倍以上的基因Table 1 Two fold up-regulated genes between test and control

2.5 Real-time PCR检测结果 Real-time PCR验证芯片结果中上调的3个基因Ifngr1、Tlr2、T lr4的表达,结果用Ct值表示样本中测定模板的起始拷贝数。Ct值越小,起始拷贝数越多,Ct值越大,起始拷贝数越小。通过制备每个目的基因的样品标准曲线和熔解曲线保证扩增结果的准确性和专一性。标准曲线的线性回归系数R2＞0.99,扩增效率在0.83～1.0之间。结果显示两个样本中内参的表达量非常接近,而Ifngr1、T lr2、Tlr4的表达量有差异,见表2。经计算其相对含量Ifngr1、Tlr2、Tlr4在实验组的表达量分别为对照组的3.05、2.27、3.40倍,与芯片结果方向一致,结果非常接近,见表3与图5,提示基因芯片检测结果可靠。

表2 Ifngr1、Tlr2、Tlr4基因在两个样本中的相对表达量Table 2 The relative expression level of Ifngr1 、Tlr2 、Tlr4 in the two samples

表3 Real-time PCR对基因芯片结果的验证Table 3 Verification of the results of microarray assay by real-time PCR

图5 Real-time PCR对基因芯片结果的验证Fig.5 Verification of the results of microarray assay by realtime PCR

3 讨 论

Ipr1基因是新近发现的与小鼠结核病易感性相关的基因,目前的研究报道也仅限于在转基因动物水平及体外细胞水平观察到该基因的表达可以增强MΦ抗分枝杆菌等胞内病原体的能力,但该基因的具体作用机制还并不明确。

本实验为了检测Ipr1的表达对M Φ抗分枝杆菌感染相关免疫基因表达的影响及Ipr1的表达是否与M Φ抗分枝杆菌感染的已知机制间有相互关联,我们应用了基因芯片技术。SupperArray的小鼠先天性与适应性免疫应答基因芯片(Oligo Innate&Adaptive Immune Responses Microarray)列有目前研究的已知的参与机体抗微生物感染免疫应答相关的113个基因位点,包括:IL-1R/TLRs成员及相关基因,与病原体识别有关的基因,炎症反应相关基因,细胞凋亡相关基因,NF-κ B信号通路相关基因,细胞因子、白细胞介素、趋化因子及相应配体基因等。检测不同标本转录水平免疫应答基因的表达差异。

在本实验中,利用上述芯片检测实验组与对照组M Φ在感染H37Ra 96h后,相关免疫基因的表达差异。对基因芯片的结果分析我们发现Ipr1的表达主要是上调MΦ抗菌感染的免疫应答基因的表达,特别是MΦ固有免疫相关的基因表达上调尤为显著。在表达上调的基因中,目前研究的较多的与M Φ抗Mtb等胞内病原体感染关系较密切的有:参与 TLRs信号途径的基因 TLR2、TLR4、Irak1、Traf6;IFN-γ受体基因Ifngr1及TNF-α受体基因Tnfrsf1a。

TLR2、T LR4、Irak1、T raf6 是参与 TLRs信号途径的基因,已经有大量的研究表明TLRs信号通路介导的MΦ抗Mtb感染在机体抗结核病的过程中发挥非常重要的作用。TLR2和T LR4是目前研究较多的与Mtb感染相关的TLRs。Mtb菌体成份或分泌成份含有一系列可以与 T LR2、T LR4相互作用的配体如LAM(脂阿拉伯甘露聚糖)、19kD脂蛋白、38kD糖脂蛋白、HSP70等,T LR2或 T LR4与相应配体结合后,可通过MyD88依赖和非依赖途径(TLR4)激活NF-κ B,引起多种炎症性细胞因子的释放及上调APC细胞表面CD80、CD86等共刺激分子,在早期抗感染固有免疫杀伤病原体及晚期调节适应性免疫应答及形成肉芽肿的过程中均发挥重要作用[7]。在TLR2/T LR4介导的MyD88依赖途径的MΦ活化过程中,M Φ内的MyD88作为一种接头蛋白与TLR2/T LR4胞内区形成复合物,继而招募并活化 IRAK-4、IRAK-1、T RAF-6,进一步激活下游级联反应最终活化NF-κ B[8],最终促进M Φ活化发挥胞内杀菌及免疫调节功能。可见在此过程中 IRAK-1、T RAF-6分子的参与与活化对TLRs信号的转导也有着重要意义。Ipr1基因上调上述基因的表达强烈提示Ipr1的表达可能与 TLR的相关基因的转录与表达有关,并参与TLRs介导的M Φ抗Mtb免疫应答。

γ干扰素(IFN-γ)是T细胞和NK细胞早期分泌的一种主要的Thl型细胞因子,在宿主M Φ控制Mtb感染过程中发挥非常重要的作用,IFN-γ主要通过刺激宿主MΦ产生一氧化氮合酶(NOS2)发挥抗Mtb感染作用[9]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是单核MΦ分泌的一种前炎症性细胞因子,TNF-α与IFN-γ协同作用激活MΦ杀死细胞内正在复制的Mtb,并与诱导Mtb感染的M Φ凋亡密切相关[10]。本实验发现Ipr1的表达上调了MΦIFN-γ R1基因的表达,说明Ipr1的表达还可能通过增加MΦ对IFN-γ刺激的敏感性而发挥抗菌作用,而 TNF R1基因的表达上调也提示Ipr1的表达还可能参与促进TNF-α介导的M Φ杀伤Mtb的过程及细胞凋亡。但是实验结果中NOS2基因的表达在实验组和对照组之间的差异却并不明显,也未检测到与凋亡相关的基因 TNF-α、NF-κ B等基因的表达差异,可能是实验设计中只是单独应用MΦ而未加入其它刺激因素的原因。

通过本实验检测到了Ipr1的表达上调了一系列MΦ抗菌免疫应答基因的表达,特别值得注意的是MΦ抗微生物感染的固有免疫应答相关的基因表达,包括TLR2/T LR4基因及信号通路有关的两个基因Irak1、Traf6,以及与MΦ活化及杀伤胞内病原体有关的细胞因子受体:Ifngr1、Tnfrsf1a。而参与MΦ调节适应性免疫应答的细胞因子有关基因IL-1、TNF-α、IL-12等表达无明显差异。提示 Ipr1的表达可能主要是通过增强MΦ固有免疫应答的杀伤吞噬的Mtb机制,尤其是TLRs活化机制的作用进而增强机体抗Mtb感染的能力,但究竟Ipr1是如何与T LRs活化机制间发生相互作用的以及Ipr1表达产物的作用位点仍需进一步的研究。

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Immune response genes expressing of Ipr1 expressed macrophage anti-M.tuberculosis

LI Na,LIU Peng-fei,LI Bo-qing,QIAO Yuan-yuan,ZHANG Yu-mei
(Department of Pathogeny Biology of Binzhou Medical College,Yantai264003,China)

To study the effect and mechanisms of Ipr1 gene expressing in macrophages infected withMycobacterium tuberculosisH37Ra use cDNA microarry.The experimental group RAW264.7 cells were transfected with pEGFP-Ipr1 and the stable Ipr1 gene expressed RAW264.7 cells were selected by G418.The control group RAW264.7 cells were transfected with pEGFP-C1and selected by G418.Experimental group and control group cells were infected byMycobacterium tuberculosisH37Ra.After 96h infection,the total RNA were isolated from the two groups.Then using a cDNA microarry(Mouse Innate and Adaptive Immune Responses Microarray113 genes)to detect the differences of experimental group and control group in gene expression related to immune response.Real-time quantitative PCR test was used to verify the reliability of the chip results.The cDNA microarry result display that Ipr1 gene expression up regulated 11 genes for macrophage anti-Mtbinnate immunity involved TLRs signaling pathway:TLR2 and T LR4,Irak1,T raf6;as well as interferon-related genes:Ifngr1(IFN-γ R1)and tumor necrosis factor-related genes:Tnfrsf1a(TNFR1),et al.And there was no significant difference about the molecular expression involved in the regulation of the adaptive immune response such as:IL-1,IL-12.The results of real-time PCR reaction TLR2 and TLR4 and Ifngr1 indicated that the real-time PCR results consistent with the trend of chip results.The results of gene chip analysis point that the Ipr1 gene expression maybe enhance macrophage anti-Mtbinfection by the mechanisms of increasing the innate immunity gene expression,in particular TLR2/TLR4 and its signal transduction molecules as well as the IFN-γ R1,TNFR1 expression,and promote macrophage activation and intracellular anti-Mtbeffect.This constitutes the basis for further study of the mechanisms of Ipr1 gene in host innate immunity against tuberculosis infection.

Ipr1;Mycobacterium tuberculosis;macrophage

R378.91

A

1002-2694(2011)08-0715-06

*山东省高等学校科技计划资助项目(J09LF01)

1.滨州医学院病原生物学教研室,烟台 264003;Email:bzy xy lina@163.com

2.滨州医学院附属医院神经外科,烟台 264003

2011-03-09;

2011-05-21