番茄红素对急性肺损伤大鼠肺毛细血管膜通透性及骨形态生发蛋白-4基因表达的影响

黄泽清，高浩然，杨 舜，侴伟平

（辽宁省肿瘤医院 麻醉科，辽宁沈阳 110042）

番茄红素对急性肺损伤大鼠肺毛细血管膜通透性及骨形态生发蛋白-4基因表达的影响

黄泽清，高浩然，杨 舜，侴伟平

（辽宁省肿瘤医院 麻醉科，辽宁沈阳 110042）

目的：观察番茄红素 （Lyc）对急性肺损伤 （ALI）大鼠肺组织毛细血管膜通透性及骨形态生发蛋白-4（BMP-4）mRNA基因表达的影响，探讨其对ALI的保护作用。方法：将Wistar大鼠随机分成3组：对照组（Ⅰ组）、ALI组（Ⅱ组），ALI+Lyc组（Ⅲ组），每组20只，每组中10只处死前注射伊文思蓝。从模型制备前1周开始，Ⅰ组和Ⅱ组用橄榄油、Ⅲ组用橄榄油稀释的番茄红素树脂（1g/L）以5ml/kg的剂量灌胃，1次/d。制备酸吸入大鼠ALI模型，测定ALI后6h肺毛细血管通透性、肺湿干质量比、肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性及BMP-4 mRNA的表达。结果：与Ⅰ组比较，Ⅱ组肺组织中伊文思蓝提取量显著增加（P＜0.01），肺湿干质量比值、MPO活性显著升高（P＜0.05），BMP-4 mRNA表达水平显著上调（P＜0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组肺组织中伊文思蓝提取量显著降低（P＜0.05），肺湿干质量比值、MPO活性明显均不同程度降低（P＜0.05），BMP-4 mRNA的表达水平显著下降（P＜0.05）。结论：番茄红素降低酸吸入致ALI大鼠的肺毛细血管通透性、肺湿干质量比及肺MPO活性，抑制BMP-4 mRNA表达，减轻ALI大鼠早期肺泡毛细血管膜损伤并可能改善后期肺组织的修复，具有肺保护作用。

番茄红素；急性肺损伤；骨形态生发蛋白

Author’s addressDepartment of Anesthesiology，Liaoning Province Tumor Hospital，Shenyang 110042，China

反流、误吸所致急性肺损伤 （acute lung injury，ALI）及由此诱发的肺部综合征一直困扰着临床医生，尽管发生率逐步降低，但一旦发生仍然缺乏有效的治疗手段，其中氧化损伤和基因表达的改变在病情的发展和转归中扮演着重要角色。番茄红素（lycopene，Lyc）是一种类胡萝卜素，具有多种生物活性如清除氧自由基、诱导细胞连接和减少淋巴细胞DNA损伤等[1，2]，目前在食品及美容保健方面得到广泛研究和应用。本研究拟通过观察番茄红素预处理大鼠ALI后肺组织毛细血管膜通透性及骨形态生发蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP-4）mRNA 表达的改变，探讨其在酸吸入致ALI中的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

PE9600 PCR仪 （美国 Perkin-elmer公司），EPS-300电泳仪（上海天能公司），HP1100高效液相色谱仪（美国Hewlett Packard公司），721A型分光光度计（重庆仪川）等。番茄红素树脂制备参考文献[3]的两步溶酶法从新鲜西红柿中提取，应用HPLC法测定其纯度，检测波长472nm，密封、避光保存，使用时用橄榄油稀释1g/L，髓过氧化物酶（MPO）（南京建成生物工程研究所）及伊文思蓝溶液等。

1.2 分组及模型制备

健康Wistar雄性大鼠60只，体重180～220g，由中国医科大学动物实验室提供。随机分成3组，每组20只，每组中10只处死前注射伊文思蓝：对照组（Ⅰ组）、ALI组（Ⅱ组），ALI+Lyc 组（Ⅲ组）。从模型制备前1周开始，Ⅰ组和Ⅱ组用橄榄油、Ⅲ组用橄榄油稀释的番茄红素树脂（1g/L）以5ml/kg的剂量灌胃，每天1次。腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，暴露气管，待大鼠呼吸频率、有创平均动脉压、心率稳定后进行如下操作：仰位颈前正中气管穿刺，Ⅰ组经气管滴入生理盐水2ml/kg后左右摇动大鼠，Ⅱ组和Ⅲ组用同样的方法滴入31.6mmol/L盐酸 （pH 为 1.5）2ml/kg建立 ALI模型，以氧合指数（PaO2/FiO2）≤40kPa作为模型制备成功的标准，清醒后常规饲养。6h后处死，处死前15min每组取10只按20ml/kg经静脉注入质量浓度为20g/L伊文思蓝溶液并标记，处死后剖胸取肺组织。

1.3 肺毛细血管膜通透性测定

取注射伊文思蓝并标记大鼠（10只）的一定量肺组织放入4ml/0.5kg/L甲酰胺溶液中浸泡，37℃恒温水浴 24h，以提取组织中的染料，在620nm处测定光密度值，用单位肺组织中染料提取量（μg/g）来反映毛细血管通透性；肺湿干质量比测定：取一定量未注伊文思蓝大鼠（10只）肺组织，用滤纸吸干表面液体，称湿质量，然后置于80℃烘箱中72h（至质量不再改变），称干质量，计算肺湿干质量比值。

1.4 肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性测定

应用比色法，按试剂盒说明操作。

1.5 BMP-4 mRNA表达的测定

取未注伊文思蓝大鼠（10只）肺组织，总RNA采用Trizol一步法提取，以GAPDH为内参，应用半定量RT-PCR检测BMP-4 mRNA表达的水平。互补DNA用BcaBEST RNA RCR试剂盒合成。 分别量取 2×Bca 1st缓冲液 10μl、MgSO44μl，dNTP 混合物 1μl，Rnase 抑制剂 0.5μl，BcaBEST多聚酶 1μl，oligo dT 引物 1μl，总 RNA 1μl，不含Rnase的 dH2O 1.5μl，共计每个样本 20μl。按以下条件进行反转录反应：65℃ 1min，30℃ 5min，65℃30min，8℃ 5min，5℃ 5min终止反应。利用如下引物及条件进行PCR反应：GAPDH引物为5'-GAA GGG TGG AGC CA-3'（上游）和5'-TGC CAG CCC CGG CA-3（下游），BMP-4引物为5'-AGC CGA GCC AAC ACT-3'（上游）和5'-CTT CTT CTT GGA CCG-3'（下游）；反应体系包括MgSO46μl，5×Bca 2nd Buffer 16μl，Bca-optimized Taq 0.5μl， 上游引物 1μl， 下游引物 1μl，dH2O 55.5μl， 共计 80μl， 然后将反应液加入到 20μl cDNA 中；PCR 反应条件为：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min循环30次，72℃扩展 5min。取RT-PCR产物10μl用含溴化乙锭的20g/L琼脂糖凝胶电泳30min（5V/cm），对电泳条带进行光密度扫描定量，用每组BMP-4和GAPDH校正光密度值之比表示BMP-4 mRNA相对表达水平。

1.6 统计学处理

表1 番茄红素对大鼠肺毛细血管通透性、肺湿干质量比及MPO的影响（n=10，x¯±s）

表2 番茄红素对大鼠肺组织BMP-4 mRNA表达的影响 （n=10， x±s）

2 结果

表1示，与Ⅰ组比较，Ⅱ组肺组织中伊文思蓝提取量显著增加（P＜0.01），肺湿干质量比值、MPO活性显著升高（均P＜0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组肺组织中伊文思蓝提取量显著降低（P＜0.05），肺湿干质量比值、MPO活性明显均显著降低 （均P＜0.05）。表2和图1示，与Ⅰ组比较，Ⅱ组BMP-4 mRNA的表达水平显著上调（P＜0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组BMP-4 mRNA的表达水平显著下降（P＜0.05）。

3 讨论

胃内容物吸入（误吸）所致的ALI是临床诱发成人呼吸窘迫综合征主要原因之一，死亡率高且缺乏有效的治疗手段。目前认为，细胞因子网络及细胞因子介导的中性粒细胞活化和黏附，并基于白细胞的呼吸爆发和降解作用所产生的髓过氧化物、氧自由基、弹性蛋白酶等损伤肺泡上皮，导致气体交换功能下降是这一病理过程的基础[4，5]。我们的研究结果显示，与对照组相比，ALI组肺组织中伊文思蓝提取量显著增加，肺湿干质量比值、MPO活性显著升高；而番茄红素组肺组织中伊文思蓝提取量显著降低，肺湿干质量比值、MPO活性均不同程度降低。番茄红素是天然单线态氧淬灭剂和氧自由基清除剂，抗氧化能力是β-胡萝卜素的2倍，维生素E的100倍。说明番茄红素的应用明显改善酸吸入致ALI后肺通透性，减轻肺损伤，对肺泡毛细血管膜损伤也具有保护作用。

我们的研究结果显示，BMP-4 mRNA的表达水平在ALI组显著上调；而番茄红素组BMP-4 mRNA的表达水平受到显著抑制。BMP-4是转化生长因子（TGF-β）超家族的成员之一，作用广泛而复杂[6，7]，ALI大鼠支气管上皮细胞的破坏使上皮-间充质模式单位激活，启动损伤修复程序，这个过程需要BMP-4、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、前列腺上皮源性转录因子（PDEF）及胰岛素样生长因子（IGF）等的参与，它们之间的平衡决定了修复的结果是接近正常的上皮还是斑痕纤维化。说明番茄红素通过改变BMP-4 mRNA的表达，具有调节酸吸入致ALI后肺组织修复的作用。

综上所述，我们把具有抗氧化作用的番茄红素应用于ALI大鼠，不仅表现出对ALI大鼠早期肺泡毛细血管膜损伤的保护作用，而且可能改善ALI后肺组织的修复。但目前对临床ALI病例应用抗氧化剂种类、剂量及应用时机的选择还有待进一步的研究。

[1]WaliszewskiKN，Blasco G.Nutraceuticalpropertiesoflycopene[J].Salud Publica Mex，2010，52（3）：254-265.

[2]Chalabi N，Delort L，Satih S，et al.Immunohistochemical expression of RARalpha，RARbeta，and Cx43 in breast tumor cell lines after treatment with lycopene and correlation with RT-QPCR[J].J Histochem Cytochem，2007，55（9）：877-883.

[3]赵文军，吴雪萍，高林，等.番茄红素的简便提取与贮藏稳定性研究[J].食品科学，2005，26（7）：152-154.

[4]Ravindranath TM，Mong PY，Ananthakrishnan R，et al.Novel role for aldose reductase in mediating acute inflammatory responses in the lung[J].J Immunol，2009，183 （12）：8128-8137.

[5]Vasudevan A，Lodha R，Kabra SK.Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome [J].Indian J Pediatr，2004，71：743-750.

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[7]Ducy P，Karsenty G.The family of bone morphogenetic proteins[J].Kidney Int，2000，57：2207-2214.

Effects of lycopene on pulmonary capillary permeability and gene expression of bone morphogeneticprotein-4 after acute lung injury in rats

HUANG Ze-qing，GAO Hao-ran，YANG Shun，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2011 Dec，25（6）：351－353

Objective：To observe the effects of lycopene （Lyc）on pulmonary capillary permeability and gene expression of bone morphogenetic protein-4（BMP-4）mRNA after acute lung injury（ALI）in rats and investigate the protection of lycopene on ALI.Methods：Sixty rats were randomly divided into 3 groups：control group（Ⅰ），ALI group（Ⅱ）and ALI+Lyc group（Ⅲ）.Animal models of ALI induced by HCL inhalation in rats were made to determine the capillary permeability，lung wet/dry weight ratio，myeloperoxidase （MPO）acticity of lung tissue after 6h and the changes of the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue.Results：Compared with groupⅠ，in groupⅡ，extraction of Evans blue in lung tissue increased very obviously （P＜0.01），lung wet/dry weight ratio，MPO of lung tissue increased obviously（P＜0.05），the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue up-regulated obviously（P＜0.05）.Compared with groupⅡ，in group Ⅲ，extraction of Evans blue，lung wet/dry weight ratio，MPO of lung tissue decreased obviously （P＜0.05），the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue downregulated obviously（P＜0.05）.Conclusion：Lycopene show a marked reductive effect on the capillary permeability，lung wet/dry weight ratio，MPO activity of lung tissue and suppress the up-regulation of the expression of BMP-4 mRNA，relieve capillary membrane injuries during prophase and may improve the restoration of lung tissue during anaphase of ALI in rats，has protective effects on lung in ALI rats.

lycopene；acute lung injury；bone morphogenetic protein-4

R364.5

A

1001-0025（2011）06-0351-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2011.06.009

辽宁省博士启动基金资助项目（20091042）

黄泽清（1973-），男，医学博士。

2011-08-16

2011-09-05