酶联免疫吸附法检测抗肝素/血小板因子4复合物抗体的临床意义

高亚玥 ，赵永强 ，王书杰 ⋆

（1．中日友好医院 血液科，北京 100029；2．北京协和医院 血液科，北京 100730）

酶联免疫吸附法检测抗肝素/血小板因子4复合物抗体的临床意义

高亚玥1，赵永强2，王书杰2⋆

（1．中日友好医院 血液科，北京 100029；2．北京协和医院 血液科，北京 100730）

目的：评价酶联免疫吸附法（ELISA）检测抗肝素/血小板因子4复合物抗体对临床诊断肝素诱导的血小板减少症（HIT）的敏感性及特异性。方法：选取应用肝素制剂患者197例（男120例、女77例），ELISA法进行HIT抗体检测，并根据临床4Ts评分法分析其敏感性和特异性。结果：临床诊断HIT患者6例，ELISA法检测HIT抗体对诊断HIT的敏感性为83.3%，特异性为90.0%，阳性预测值为20.8%，阴性预测值为99.4%。结论：4Ts评分系统仍是目前临床诊断HIT的重要依据，HIT抗体的检测对HIT诊断的敏感性及特异性较好、可用于辅助诊断HIT。

肝素诱导的血小板减少症；酶联免疫吸附法；抗肝素/血小板因子4复合物抗体

Author’s addressDepartment of Hemology，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China

肝素诱导的血小板减少症 （heparin-induced thrombocytopenia，HIT）是指应用肝素制剂期间或之后出现血小板计数的减少。应用肝素制剂后血小板被激活，释放出血小板因子4（PF4），形成肝素/PF4复合物，激活免疫系统产生抗肝素/血小板因子4复合物抗体，即HIT抗体 （anti-heparin/platelet factor 4 complex antibodies，HIT-antibody），从而进一步激活血小板，引起血小板聚集，导致血小板减少和继发血栓形成。目前对HIT的临床诊断主要依据4Ts评分系统。HIT抗体的实验室检测方法主要有肝素诱导的血小板聚集试验（HIPA）、14C-血清素释放试验（SRA）和酶联免疫吸附测定 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。SRA试验的敏感性和特异性较高，被认为是诊断HIT的金标准，但技术要求高、具有放射性，仅能在少数有条件的实验室完成。ELISA法操作相对简单、应用较广，但各家试剂标准尚不统一，已有报道的敏感性和特异性存在较大差异。我国目前尚无关于ELISA法检测HIT抗体对HIT诊断价值的相关研究。

本研究中，我们对肝素制剂治疗的患者应用ELISA方法测定HIT抗体，对其诊断HIT的敏感性和特异性进行研究。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2008年11月～2009年5月间，在中日友好医院和北京协和医院住院并接受普通肝素（unfractionated heparin，UFH） 或低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）治疗的患者共197例，其中男120例、女77例，平均年龄64岁。选取门诊健康体检者30例做为空白对照，其中男18例、女12例，既往无肝素制剂应用史。

1.2 方法

健康体检者及患者应用UFH或LMWH之前，检测血小板计数、肝肾功能、凝血功能等。患者应用UFH或LMWH之后每周检测血小板计数2～3次，凝血功能、肝肾功能1～2次。健康体检者在体检当天、入选患者在应用肝素制剂后第5～7d（平均6.5d），用血清分离管采集静脉血4ml，于室温放置2h后以1000g离心20min，提取上清液分装，置于-80℃冰箱内保存、以备HIT抗体检测。

应用USCNLIFE-武汉中美科技有限公司生产的HIT抗体 （即人抗肝素/PF4复合物抗体）ELISA试剂盒检测HIT抗体，具体步骤参照厂商说明书。结果判读：以健康体检者HIT抗体检测平均值±2个标准差为阈值，小于此值为阴性，大于此值为阳性，本研究30例健康体检者HIT抗体检测平均值为4.66U/L，标准差为1.25U/L，定义：HIT抗体＞7.16U/L为阳性，＜2.16U/L为阴性。

根据Warkentin等建议的4Ts评分系统 （见表1），即应用肝素制剂后出现血小板减少的时间、程度、有无新发血栓及能否除外其他引起血小板减少的原因这四个方面，对每例患者进行4Ts评分，高可能性 （6～8 分）， 中可能性 （4～5 分），低可能性 （0～3分）1，评分为6-8分的高可能性患者临床诊断为HIT。

1.3 统计指标及方法

统计临床诊断HIT的例数及ELISA法检测出HIT抗体阳性的例数，评价ELISA法检测HIT抗体对临床诊断HIT的敏感性和特异性。敏感性：患病发现的能力，即阳性检测的样本占患病总数的百分比；特异性：无病发现的能力，即阴性检测的样本占无病总数的百分比；阳性预测值（PPV）：在阳性检测的样本总数中，患病样本占阳性检测样本总数的百分比；阴性预测值（NPV）：在阴性检测的样本总数中，无病样本占阴性检测样本总数的百分比。

2 结果

2.1 临床诊断HIT

197例患者中，临床诊断HIT（4Ts评分高可能性）共6例，包括表2中的1～5例，还有 1例HIT抗体检测阴性患者，其诊断为系统性硬化症、深静脉血栓症，应用LMWH后d10出现血小板减少，低至27×109/L，有新发血栓形成，其4Ts评分为6分。

2.2 HIT抗体阳性患者的临床特点

197例患者中，HIT抗体检测阳性24例、阳性率12.2%，其中临床诊断HIT 5例、非HIT 19例。非HIT患者中出现血小板减少症2例，均为轻度、一过性减少，未停用肝素制剂很快恢复正常，原因可能为Ⅰ型HIT；其余17例既无血小板减少、也无新发血栓形成，4Ts评分均为0分。

2.3 HIT抗体测定对HIT诊断的敏感性与特异性

据表3计算可得出，ELISA法检测HIT抗体对诊断HIT的敏感性为83.3%，特异性为90.0%，阳性预测值（PPV）为20.8%，阴性预测值（NPV）为99.4%。

表1 HIT临床诊断的“4Ts”预测评分系统

表2 24例HIT抗体阳性患者临床资料

3 讨论

目前，对ELISA法检测HIT抗体尚无统一标准，试剂盒也存在国内、外多个不同厂家，有定量及定性两种，还有特异性检测IgG型抗体的试剂盒。不同实验室报道的HIT抗体检测结果亦不甚相同，国内尚无大宗报道，国外几项较大样本的研究结果显示，ELISA法检测HIT抗体的敏感性93%～100%、特异性 48.7%～81.7%[2～4]，综合多数报道来看，ELISA法检测HIT抗体对诊断HIT具有较高的敏感性（＞90%）和中等程度的特异性（50%～90%）[1]。本此研究的敏感性（83.3%）及特异性为（90.0%）尚可，但 PPV 较低（20.8%）。

表3 临床诊断HIT与HIT抗体检测结果 n

HIT抗体检测的特异性及PPV偏低的原因有以下几个方面：检测出的抗体为一过性、非致病性的 IgA 和 IgM 型抗体[3，4]；或为隐性 HIT（有 HIT抗体产生，但无血小板减少）及孤立性HIT（有HIT抗体产生及血小板减少，但无血栓形成）5；采用以健康人群检测结果的平均值±2个标准差做为阈值，故存在一定的局限性。今后需扩大临床试验，健康人群数量，并与金标准14 C-血清素释放试验进行比较验证。

有3种情况可能导致HIT抗体检测出现假阳性[6～8]：正常人体内存在许多硫酸多糖类物质可替代肝素与PF4结合，引起PF4抗原性改变，产生针对PF4的抗体；试剂盒自身包被的抗原不纯，可与正常人血清中的免疫球蛋白物质产生免疫反应；或包被的抗原与正常人血清中的其他蛋白产生交叉反应。人体内一些非PF4的物质，如白介素-8（IL-8）和中性粒细胞激活肽-2（NAP-2），可与肝素制剂结合引起HIT的发生，此种情况下不能检测出HIT抗体，导致出现假阴性结果。

研究显示，4Ts评分低分值具有较高的NPV（98.4%～100%），而4Ts评分高分值具有较高的PPV（100%）[6，9]。 因此，4Ts评分系统仍是目前诊断HIT的重要依据。理论上，联合临床4Ts评分和实验室检查可提高HIT诊断的准确性。结合本研究和文献报道我们认为，若患者4Ts评分为低、中可能性，同时抗体阴性时可基本除外HIT；若4Ts评分为高可能性，同时抗体阳性时可基本诊断HIT；若4Ts评分为低、中可能性，而抗体阳性，需进一步检测抗体类型以除外非致病性IgA或IgM型抗体，若为特异性IgG抗体则考虑为隐性或孤立性HIT，或可进行SRA、HIPA等实验加以证实；因ELISA存在一定的假阴性结果、敏感性不能达100%，若4Ts评分为高可能性、但抗体阴性，可进行SRA、HIPA等实验进一步确证。若无法开展SRA、HIPA等功能检测，可重复ELISA法检测HIT抗体，最好检测特异性IgG型抗体。

综上所述，4Ts评分系统仍是目前临床诊断HIT的重要依据，ELISA法检测HIT抗体敏感性及特异性尚可，可以辅助用于临床诊断，联合4Ts评分和HIT抗体检测可提高确诊和除外HIT诊断的准确性。

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Detection and evaluation of heparin-induced thrombocytopenia antibody in patients treated with hep-arin preparations

GAO Ya-yue，ZHAO Yong-qiang，WANG Shu-jie//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2011 Dec，25（6）：331－333

Objective：To evaluate the clincial value of heparin-induced thrombocytopenia antibody （HIT-antibody）detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）in the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia （HIT）.Methods：A total of 197 consecutive patients，including 120 males and 77 females，who were treated with heparin preparations，were enrolled in our study.HIT-antibody was detected by ELISA kits，and HIT was diagnosed based on “4Ts” Pretest Clinical Scoring System.The sensitivity and specificity of HIT-antibody assay for the diagnosis of HIT were analyzed.Results：Six patients were clinically diagnosed as HIT.HIT antibody assay had a sensitivity of 83.3%and a specificity of 90.0%，and its positive predictive value was 20.8%and negative predictive value was 99.4%in the diagnosis of HIT.Conclusion：“4Ts” scoring system is still the most important criterion for the diagnosis of HIT at present.The ELISA HIT antibody assay showed a certain satisfactory sensitivity and specificity and could be used to assist the diagnosis of HIT.

heparin-induced thrombocytopenia；enzyme-linked immunosorbent assay；anti-heparin/platelet factor 4 complex antibodies

R558+.2，R446.61

A

1001-0025（2011）06-0331-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2011.06.003

2*本文通讯作者。

高亚玥（1978-），女，住院医师，医学硕士。

2011-09-14

2011-10-19