膀胱癌中p53诱导基因3的表达及意义

刘海波，孔垂泽

（中国医科大学附属第一医院泌尿外科，沈阳 110001）

许多研究表明，p53蛋白表达是膀胱癌发生发展中的重要因子，p53行使其生物学效应主要通过p53蛋白与特异基因序列结合后，激活下游基因的表达来实现［1］。PIG3为p53诱导基因3（p53 inducible gene 3），是p53的下游基因之一，其基因全长7424 bp，定位于2p23.3，编码分子量约35kD的蛋白质，其在膀胱癌发生发展中的作用目前尚不明确。本研究检测40例膀胱癌标本及15例非肿瘤膀胱组织中PIG3蛋白表达情况，探讨其在膀胱癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择中国医科大学附属第一医院泌尿外科患膀胱癌而行膀胱全切或部分切除术的标本40例，及距肿瘤≥3 cm的膀胱组织标本15例为实验对象。所有标本均得到患者授权。病例组40人，年龄42～87岁，平均年龄59岁，其中临床分期T118例，T213例，T39例；术后病理分级G119例，G215例，G36例；复发性膀胱癌7例。对照组15例，年龄54～85岁，平均年龄63岁。手术切取的膀胱标本立即于无菌条件下放入消毒后的Eppendof管内，于液氮中30 min后放入-70℃深低温冰箱冻存备用。

1.2 主要药品、试剂及仪器

药品及试剂：鼠抗人PIG3单克隆抗体购自美国Oncogene公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG购自美国Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自瑞典Pharmacia公司；硝酸纤维素膜购自美国Bio-rad公司。

实验仪器：2K15C型低温超速离心机为美国Sigma公司产品；Chemi Imager 5500电泳凝胶成像系统为美国Alpha公司产品；VC50T型超声粉碎仪为美国Sonics&Materials公司产品；DIAX900型匀浆机为德国Heidolph公司产品；MultiphorⅡ型电泳仪为瑞典Pharmacia Biotech公司产品；Trans-Blot SD型半干转膜仪为美国Bio-rad公司产品；UV300型紫外分光光度计为英国Unicam公司产品。

1.3 实验方法

Western blot方法检测PIG3蛋白表达。先提取各样本组织的总蛋白，采用福林-酚法（lowry法）测定蛋白浓度后，煮沸变性5 min后备用。取40 μg蛋白样品行SDS-PAGE电泳（3%浓缩胶，5%分离胶），半干转膜法转膜。鼠抗人PIG3单克隆抗体（1∶200）孵育过夜，洗膜，1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG孵育2 h，之后显色。Chemi Imager 5500电泳凝胶成像系统成像，应用Fluorchem v2.0凝胶成像分析软件测定各条带的积分吸光度值，计算各组样本中PIG3蛋白含量的变化。同样步骤加入鼠抗人β-actin单克隆抗体，检测样品中β-actin的蛋白表达作为内参照。

1.4 统计学处理

所得数据以±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，显著性检验采用单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

病例组及对照组均于同一位置（35 kDa）出现单一条带（图1）。对照组PIG3蛋白表达积分吸光度值为141.8±11.9；病例组的PIG3蛋白表达积分吸光度值随病理分级升高而明显减少，其中G1，G2，G3级PIG3蛋白表达积分吸光度值分别为96.3±8.7，30.7±3.6，19.9±2.9，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；随临床分期升高，PIG3蛋白含量亦明显下降，其中T1与T2+T3组PIG3蛋白表达积分吸光度值分别为 75.4±12.5，32.1±5.4；组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；复发性膀胱癌PIG3蛋白表达积分吸光度值为42.7±6.2，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。各组PIG3蛋白表达值见表1。

图1 膀胱癌组织中表达PI G 3蛋白情况Fig.1 The level of PIG 3 protein in the bladders

表1 病例组及对照组中PI G 3蛋白积分吸光度值Tab.1 The level of PIG 3 protein in the cases

3 讨论

野生型p53诱导凋亡的途径之一，是通过PIG3的激活来促进活性氧簇的产生，进而诱导凋亡［2］。Contente等［3］研究发现：野生型p53直接而且特异地与PIG3中（TGYCC）15序列反应，PIG3通过野生型p53的过度表达而激活，这种PIG3激活与诱导凋亡之间的关联提示PIG3的激活或相似调节有助于p53介导的细胞凋亡，在p53调节的生长抑制期间，PIG3水平显著改变［4］。近来有研究表明PIG3在DNA损伤应答路径中是一个关键因子［5］，在对乳腺癌和肺癌及白血病的研究中发现了PIG3表达水平的显著变化［6～8］。突变型p53蛋白高表达多见于高分期及高级别肿瘤，与肿瘤复发，进展和整体生存时间缩短有关，而p53突变后不能激活PIG3启动子，也不能诱导凋亡，这提示PIG3可能与恶性肿瘤的发生发展有关。

我们的研究结果显示：各组病理分级及临床分期的膀胱尿路上皮癌组织中PIG3蛋白表达积分吸光度值与对照组比较，均有明显差别。随着病理分级升高，PIG3蛋白表达值明显降低，对照组与G1、G2、G3级比较，差异均有统计学意义（P<0.05），提示PIG3蛋白表达的多少与膀胱癌的恶性程度有着密切关联；随着临床分期升高，PIG3蛋白表达呈下降趋势，对照组与T1组及T2+T3组两两比较差异有统计学意义（P<0.05），表明PIG3蛋白表达的多少与膀胱癌的浸润及进展程度有着紧密联系。以上结果也证实了PIG3蛋白在膀胱癌的发生、发展及预后判断中有着重要作用。本研究发现：复发性膀胱癌患者的PIG3蛋白表达水平较G1级及T1组中PIG3蛋白表达值明显减少，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。这提示PIG3蛋白表达降低与膀胱肿瘤复发或转移的危险性增加有关，如果在早期和低级别膀胱肿瘤检测到PIG3蛋白表达值减少，则可能提示该患者有早期转移趋势或高复发风险，应加强综合治疗和定期复诊。

说明PIG3蛋白在膀胱癌的发生、发展中有着特定作用，其表达减少可能是膀胱癌进展及浸润转移的指征。我们认为：临床上对PIG3蛋白的监测和研究将有助于膀胱癌的早期诊断及鉴别诊断，并能够预测肿瘤的发展趋势和转移倾向，有望成为一种新的膀胱肿瘤标记物和新的临床诊断指标。

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［2］Porté S，Valencia E，Yakovtseva EA，et al.Three-dimensional structure and enzymatic function of proapoptotic human p53-inducible quinone oxidoreductase PIG3 ［J］.J Biol Chem，2009，284（25）：17194-17205.

［3］Contente A，Dittmer A，Koch MC，et al.A polymorphic microsatellite that mediates induction of PIG3 by p53［J］.Nat Genet，2002，30（3）：315-320.

［4］Flatt PM，Polyak K，Tang LJ，et al.p53-dependent expression of PIG3 during proliferation genotoxic stress and reversible growth arrest［J］.Cancer Lett，2000，156（1）：63-72.

［5］Lee JH，Kang Y，Khare V，et al.The p53-inducible gene 3（PIG3）contributes to early cellular response to DNA damage［J］.Oncogene，2010，29（10）：1431-1450.

［6］Gorgoulis VG，Liloglou T，Sigala F，et al.Absence of association with cancer risk and low frequency of alterations at a p53 responsive PIG3 gene polymorphism in breast and lung carcinomas［J］.Mutat Res，2004，22，556（1-2）：143-150.

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