吉林省延边地区猪附红细胞体病分子流行病学调查

刘明明，贾立军，薛书江，梁晚枫，张守发

（延边大学农学院动物医学系，吉林延吉 133002）

附红细胞体病（Eperythrozoonsis）是由附红细胞体（Eperythrozoon）寄生于红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种以高热、贫血、黄胆等为主要临床特征的人畜共患病[1-3]。猪、牛、羊、马、犬、猫、鸡和鼠等多种动物及人均可感染发病，其中以猪附红细胞体病最为严重[4]。不同品系、性别和年龄的猪均可感染附红细胞体病，四季均有发生，以夏秋两季更易发病。该病多以隐性感染为主，在从未感染过的地区则常出现严重的地方性流行和暴发，不仅给畜牧业带来巨大的经济损失，还严重影响人类的身心健康[5]。本试验应用PCR方法对2009—2011年间采自吉林省延边地区的237头份猪血液样本进行了猪附红细胞体病流行病学调查，旨在为延边地区猪附红细胞体病提供科学的流行病学资料，以便有效控制该病的流行与发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源

237份猪血液样本采自吉林省延边地区延吉、和龙、图们、珲春及龙井等5个县市，颈静脉无菌采集抗凝血，-20℃保存，备用。

1.1.2 主要试剂

rTaq DNA 聚合酶、DNA Marker、DNA 提取试剂盒等均购自大连宝生物工程有限公司；其它试剂均为国产分析纯级产品。

1.1.3 引物的设计与合成

根据GenBank中登录的猪附红细胞体膜蛋白OxaA 序列（CBZ40902.1），应用 Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计引物，上游引物 P1：5'-TCTTATGTCTTTGTTGTAAATCTG-3'；下游引物 P2：5'-TTTTCAATCTATGTTCACCTCA-3'。扩增片段大小386 bp；对照用引物的靶基因为16 S rRNA，上游引物 P1：5'-CGAAAGTCTGATGGAGCAATAC-3'；下游引物 P2：5'-AACCAAACATCTCAAGACACGA-3'，扩增片段大小703 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR检测

将采集的237份猪血液样本，应用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，以膜蛋白OxaA为靶基因的PCR扩增体系为25μL：10×Bufer 2.5 μL，dNTP 2 μL，rTaq DNA Polymerase 0.3μL，引物（10 pmol／L）各 1.5μL，DNA 模板 2 μL。优化后的扩增程序为：95℃预变性5 min；94℃变性45s，57℃退火 45s，72℃延伸 45s，共 30 个循环；72℃延伸7 min，4℃结束反应。同时进行16 S rRNA靶基因的PCR扩增[6]。1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.2 检测结果的比较

应用敏感性最好的靶基因PCR方法对吉林省延边地区5个县市采集的237份猪血液样本，进行不同地区、不同年龄段、不同季节及不同饲养方式的猪附红细胞体感染情况的比较。

2 结果

2.1 两种不同靶基因引物的PCR检测结果

以猪附红细胞体膜蛋白OxaA序列（CBZ40902.1）设计引物建立的PCR方法对采集的237份猪血液样本进行检测，同时与16 S rRNA设计引物的PCR方法进行比较。结果表明，以膜蛋白OxaA为靶基因的PCR方法较16 S rRNA为靶基因的PCR方法阳性检出率高，结果见表1。故选择膜蛋白OxaA为靶基因的PCR方法作为此次流行病学调查的最佳方法（见表1）。

表1 两种不同靶基因引物的PCR检测结果比较

2.2 不同地区猪附红细胞体感染情况PCR检测结果

以靶基因膜蛋白OxaA为引物的PCR为准，对237份采自延吉、和龙、图们、珲春和龙井5个县市的血液样本进行PCR检测，结果见表2。经统计学分析，各县市猪附红细胞体感染率差异不显著（P＞0.05）（见表 2）。

表2 不同地区猪附红细胞体感染情况比较

2.3 不同年龄猪感染附红细胞体情况PCR检测结果

以靶基因膜蛋白OxaA为引物的PCR为准，对237份不同年龄的种母猪、育肥猪、断奶仔猪和哺乳仔猪的血液样本进行PCR检测，感染情况见表3。经统计学分析，不同年龄猪感染附红细胞体阳性率差异不显著（P＞0.05）（见表 3）。

表3 不同年龄猪感染附红细胞体情况比较

2.4 不同季节猪感染附红细胞体情况PCR检测结果

以靶基因膜蛋白OxaA的引物为准，对237份采自不同季节的血液样本进行PCR检测，经统计学分析，夏秋两季猪附红细胞体阳性率显著高于冬春两季（P＜0.05）（见表 4）。

表4 不同季节猪感染附红细胞体情况比较

2.5 不同饲养方式猪感染附红细胞体情况PCR检测结果

以靶基因膜蛋白OxaA的引物为准，对237份采自不同饲养方式的血液样本进行PCR检测，经统计学分析，农户饲养方式猪附红细胞体阳性率显著高于规模化养殖方式（P＜0.01）（见表5）。

表5 不同饲养方式猪感染附红细胞体情况比较

2.6 部分临床样本的PCR检测结果

以靶基因膜蛋白OxaA的引物为准，对237份血液样本进行PCR检测，部分临床样本PCR检测结果见图1。

3 讨论

附红细胞体为条件性致病微生物，当动物机体免疫力下降或感染其它病原时，附红细胞体在血液中就会大量增殖，继发引起各种疾病的交叉感染，导致动物死亡，极大影响了畜牧业健康发展[7-8]。本次调查采用了PCR方法对吉林省延边地区237头份猪血液样本进行检测，并事先对两种不同靶基因的引物进行比较，排除假阴性样本的干扰，以便更为准确的检测出猪附红细胞体病。

本次调查对检测的237头份猪血液样本按不同地区、年龄、季节及饲养方式的感染情况分别进行了比较，结果表明猪附红细胞体的感染与季节和饲养方式的关系较密切，受地区和年龄影响较小。

调查结果显示，吉林省延边地区在2009—2011年间猪附红细胞体的平均感染率为23.6%，这与2008年李月梅等对吉林省猪附红细胞体感染率的调查相比有明显的下降[9]，但与国外研究结果显示的附红细胞体在猪群中的患病率约为10%~15%相比还是偏高[10]。因此，附红细胞体病作为养猪业的潜在威胁，其危害不容忽视。鉴于目前附红细胞体病的研究现状，对猪附红细胞体病的防治研究仍是一项艰巨任务。

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