广西牛群戊型肝炎病毒感染情况调查

李 斌 ，苏乾莲 ，赵 武 ，秦毅斌 ，梁家幸 ，何 颖 ，梁保忠 ，严子斌 ，覃 勇 ，韦建华 ，段群棚 ，许力匆

（ 1. 广西兽医研究所，广西南宁 530001；2. 横县动物疫病预防控制中心，广西横县 530300；3. 百色市动物疫病预防控制中心，广西百色 533000；4. 河池市动物疫病预防控制中心，广西河池 547000 ）

养牛业是广西的优势和特色产业，但至今尚未见广西牛HEV感染检测的相关报道。本研究应用反转录—套式聚合酶链式反应（RT-nPCR），对采自广西8个市牛粪、肝样品进行HEV检测，为广西牛群HE的流行病学研究及监测防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 牛粪、牛肝样品

采自广西8个市的奶牛场、屠宰场、菜市场的新鲜牛粪样品183份、新鲜牛肝样品25份。

1.2 HEV RNA检测的阳性、阴性对照

阳性对照：经RT-PCR检测和核苷酸序列测定为HEV阳性的猪粪病料；阴性对照：本实验室采集的，经RT-PCR检测为猪流行性腹泻病毒（PEDV）阳性的猪粪病料。

1.3 RNA抽提及RT-PCR试剂

Trizol Reagent购 自Invitrogen公 司，M-MLV逆转录酶购自Promega公司，RNA酶抑制剂购自宝生物工程（大连）有限公司，Taq酶购自Fermentas公司，dNTPs购自生工生物工程（上海）有限公司，DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司，DEPC H2O自己制备。

1.4 引物合成

根据基因Ⅰ-Ⅳ型HEV的ORF2基因序列，合成两对简并引物进行RT-nPCR[1]，这两对引物可扩增四种基因型HEV的ORF2保守区内基因序列，其内套PCR扩增产物大小为436 bp。引物序列如下，外套引物HEV-A：5'-TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG-3'，HEV-B ：5'-TG YTGGTTRTCRTARTCCTG-3'；内套引物HEV-C：5'-AC YTCHGGBGTBGCKGAGGA-3'，HEV-D：5'-GCTCGCC ATTGGCTGAGAC-3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.5 RNA模板的提取

用Trizol Reagent对处理好的牛粪、牛肝样品及HEV阳阴性对照病料进行总RNA的提取。

1.6 反转录

RT反应采用25 μL反应体系，其组成如下：5×RT Buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，引 物 HEV-B（25 μmol/L）1μL，RNA 酶 抑 制 剂（40U/ μL）0.5 μL，M-MLV 逆转录酶（200U/ μL）0.5 μL，RNA 模板 16 μL。RT反应条件：42 ℃ 60 min，最后终止于4 ℃。

1.7 套式PCR扩增

套式PCR反应采用25 μL反应体系，外套PCR组成 如 下 ：DEPC H2O 17.6 μL，10×Dream Taq Buffer（includes 20 mmol/L MgCl2） 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，外 套 PCR 引 物 HEV-A、HEV-B（25 μmol/L）各 0.5 μL，Dream Taq 酶（5U/ μL）0.4 μL，cDNA 模 板3 μL ；内套 PCR 组成如下 ：DEPC H2O 17.6 μL，10×Dream Taq Buffer （includes 20 mmol/L MgCl2）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，内 套 PCR 引物 HEV-C、HEV-D（25 μmol/L）各 0.5 μL，Dream Taq 酶（5U/ μL）0.4 μL，外套 PCR 产物模板 3 μL。外、内套PCR均为相同的反应条件：95 ℃预变性5 min，进入循环95 ℃ 50 s→53 ℃ 50 s→ 72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min，终止于4 ℃。

1.8 PCR产物的检测

取 20 μL 内 套 PCR 扩 增 产 物，加 入 4 μL6×Loadding Buffer，于混有EB替代物的1%琼脂糖凝胶中以120 V 100 mA电泳40 min，于紫外灯下观察电泳结果，并于凝胶成像系统拍照保存结果。

1.9 检测结果统计分析

应用统计学软件SPSS13.0对广西8个市样品牛HEV检测阳性率结果数据进行单样本非参数检验（卡方检验），对分别检测广西牛粪、牛肝样品HEV检测阳性率结果数据进行两独立样本非参数检验（Mann-Whitney U 检验）[2]。

2 结果

2.1 RT-nPCR扩增产物电泳结果

检测HEV为阳性的牛粪、牛肝样品和HEV阳性对照病料的内套PCR扩增产物经电泳后都可见436bp特异性目的条带，而阴性对照病料的内套PCR扩增产物经电泳后则无此条带（图1）。

2.2 RT-nPCR检测广西8个市样品牛HEV结果统计分析

在所检广西8个市样品中，HEV阳性率最高的是梧州市（72.73%），阳性率最低的是百色市（0%）。其余6个市样品的检出HEV平均阳性率为15%（24/160）（表1）。用统计学软件SPSS13.0对广西8个市样品牛HEV检测阳性率结果数据进行卡方检验（Chi-Square Test），结果卡方值 χ2=122.414，相伴概率（Asymp.Sig.）P=0.000，小于显著性水平0.05，所以广西8个市样品牛HEV检测阳性率存在显著性差异。这可能与各地样品的检测数量及样品是否采自牛HEV排毒期等因素相关。

2.3 RT-nPCR分别检测广西牛粪、牛肝样品HEV结果统计分析

应用RT-nPCR所检测的广西6个市牛粪HEV的阳性率最高为87.5%（14/16），最低为0%（0/20），平均阳性率为19.13%（35/183）；所检测的广西4个市牛肝HEV的阳性率最高为33.33%（2/6），最低为0%（0/6），平均阳性率为 20%（5/25）（表 2）。用统计学软件SPSS13.0对牛粪、牛肝样品HEV检测阳性率结果数据进行两独立样本的Mann-Whitney U检验，结果该法的Z检验统计量Z=-0.430，双侧检验相伴概率（Asymp. Sig.）P=0.667，单侧检验 P=0.333 5，大于显著性水平0.05，因此分别检测广西牛粪、牛肝样品的HEV检测阳性率差异不显著。

表1 广西8个市样品牛HEV检测结果

表2 分别检测广西6个市牛粪、4个市牛肝样品的HEV检测结果

3 讨论

对广西8个市牛粪、肝样品HEV RNA检测结果表明，梧州市样品牛HEV阳性率很高，为72.73%（16/22）；而百色市样品牛HEV阳性率为0%（0/26）。对广西8个市样品牛HEV阳性率差异进行统计分析，结果P＜0.05，表明广西8个市牛HEV感染率的差异显著。这可能与检测样品的数量、样品的代表性有关，也可能与广西这8个市的地形环境、气候条件、养牛业状况及牛相关产品流通等因素的差异有关。

应用RT-nPCR从广西6个市牛粪样品中检出HEV的阳性率为19.13%（35/183），从广西4个市牛肝样品中检出HEV的阳性率为20%（5/25）。对两种不同样品检出HEV阳性率的差异进行统计分析，结果P＞0.05，表明从两种样品检出HEV的阳性率差异不显著。而且从牛粪检测HEV RNA较之从牛肝检测HEV RNA有2个优点：（1）牛粪可方便地采样，不用杀牛取肝，牛粪的采样成本很低；（2）牛粪可直接稀释离心取上清用于检测，而牛肝则需磨碎、冻融处理后离心取上清用于检测，牛粪样品处理较为简易。所以牛粪HEV RNA检测更适于作为牛群HE的病原监测手段。

[1] 王彤. 医学统计学与SPSS软件应用[M]. 北京： 北京大学医学出版社， 2008.

[2]li W, She R, Wei H, et al. Prevalence of hepatitis E viurs in swine under different breeding enviromnent and abattoir in Beijing, China[J]. Vet Microbial, 2009,133(1/2):75-83.