鸡胚致病性大肠杆菌的分离与鉴定

刘国庆，温建新，赵鹏伟，李倩倩，刘 坤

（1.胶南市动物疾病控制中心，山东青岛 266400；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

2011年4月，在胶州某种鸡场19日龄鸡胚死亡数量增加，经剖检时可见卵黄吸收不良，大多为黄绿色物质，肝脏肿大出血，经过分离培养、生化试验和溶血试验确诊为致病性大肠杆菌，通过药敏试验检测了病原菌对药物的敏感性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 胶州某种鸡场的一批待检的19日龄病死鸡胚。

1.1.2 试验材料 普通营养琼脂培养基、肉汤培养基、伊红美蓝培养基（EMB）、三糖铁培养基（TSI）、用兔血配制的血平板培养基、柠檬酸盐琼脂、葡萄糖蛋白胨水；五糖发酵管（葡、麦、蔗、乳、甘）、H2S、靛基质、MR试剂、VP试剂、吲哚试剂、药敏纸片（购自杭州天和微生物试剂有限公司）；E.coli标准“O”血清、标准菌株均购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检 随机抽取42只鸡胚，观察尿囊液的变化及内脏的病理变化。

1.2.2 细菌的分离、纯化及形态学观察 将病料分别无菌接种到肉汤培养基上，37 ℃培养24 h后，用灭菌环挑去肉汤中的培养物分别接种到EMB培养基上，37 ℃培养24 h。挑去EMB培养基上的单个菌落进行革兰氏染色，镜检。

1.2.3 生化试验 挑取在经革兰氏染色后呈阴性短杆菌的EMB黑色带有在金属光泽菌落在普通营养琼脂培养基上进行纯化培养后，按照常规方法进行TSI、糖发酵试验[1]、IMViC。

1.2.4 溶血性试验 从EMB培养基中挑取单个菌落接种到兔血配制的血平板上，置于37 ℃培养24 h，观察培养基中是否产生溶血现象。

1.2.5 药敏试验 采用纸片扩散试验法。其操作方法如下：将分离得到的大肠杆菌和标准菌株在无菌条件下分别接种于肉汤中，然后放入摇床中培养 12 h 后计数，调节菌液的含菌量为108个/mL。按常规操作贴好纸片置于 37 ℃培养 12 h 后观察结果。

2 结果与分析

2.1 剖检变化

剖检时可见卵黄吸收不良，大多为黄绿色物质，肝脏肿大出血，羊膜腔出血

2.2 细菌的分离培养

经37 ℃培养在肉汤中均出现浑浊，管底有黏性沉淀，液面管壁有菌环；在EMB培养基上出现黑色带有金属光泽的菌落；挑取得单个菌落接种到普通培养基上形成表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形凸起、中等大小菌落

2.3 细菌形态学观察

经革兰氏染色镜检后，均可见粉红色、两端钝圆、多数散在排列的革兰氏阴性短杆菌。

表1 病原菌生化试验结果

2.4 生化试验结果（见表1）

由表1可见，从鸡胚尿囊液和肝脏中分离的细菌都利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇，但不利用蔗糖；吲哚试验出现玫瑰红色，说明呈阳性，不产生H2S；枸橼酸盐不变色，呈阴性；MR试验中液体呈现红色，说明呈阳性；VP试验观察到没有颜色变化，说明呈阴性；TSI斜面、底部均为黄色，底层产气。经过以上生化试验，可以确诊该批鸡胚感染了大肠杆菌。

2.5 溶血试验结果

血平板上出现明显的溶血现象，说明分离到的大肠杆菌具有致病性。

2.6 药敏试验结果（见表2）

表2 药敏试验结果

3 讨论

3.1 对生化试验和溶血试验结果的讨论

本试验通过分离培养和染色镜检观察细菌形态疑似该病原菌为大肠杆菌后，把分离到的细菌进行生化试验，该菌能够利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖产酸，而不能利用蔗糖。典型的大肠杆菌一般都对葡萄糖和乳糖产酸产气，但可能不同血清型的细菌可能生化反应不完全一致。在进一步做IMViC试验的结果与大肠杆菌的生化特征基本一致。可以进一步确诊该批鸡胚是感染大肠杆菌致死。另外，血平板上出现明显的溶血现象，说明大肠杆菌具有一定的致病性。

3.2 致病性大肠杆菌耐药性的变化

大肠杆菌极易产生耐药性，不同地区致病菌的耐药性差异较大。从分离得到的致病性大肠杆菌药敏结果可以看出；对美福仙高度敏感，对庆大霉素、先锋V中度敏感，而对克林霉素、环丙沙星、阿米卡星、万古霉素、红霉素、氯霉素、氨苄青霉素、四环素和青霉素G不敏感。可以考虑用美福仙、庆大霉素、先锋V药物对鸡大肠杆菌病进行治疗。因此，通过药敏试验进行治疗十分有效的，不仅能测定细菌对药物的敏感性，且有助于选择合适的药物，为药物的用量提供依据[2-3]。然而在临床治疗中投药的剂量不足，用法不当，无明确适应症而滥用抗菌素类药物，特别是长期应用时，往往引起耐药菌株的产生高敏抗生素的长期使用，必定会产生耐药性的菌株[4]。鸡大肠杆菌病产生耐药性的原因据记载：在临床治疗大肠杆菌病时，必须注意合理使用药物，加强抗生素药物的质量监督，注意细菌耐药性的检测，有效的限制耐药性的产生；同时，要加强不同抗生素的联合使用。总之，细菌耐药性是目前养殖业所面临的重大问题之一。

3.3 对防治鸡胚感染大肠杆菌的建议

大肠杆菌是条件性致病菌，危害养殖业的重要病原菌，凡能引起机体抵抗力降低的各种因素均是引发本次疾病的原因，特别是各种病毒的感染，都可以诱发大肠杆菌病。防治该病的关键在于贯彻“养重于防，防重于治”的方针[5]。

因为鸡胚感染大肠杆菌主要是母体垂直传播或外界环境污染所致，所以要预防鸡胚感染大肠杆菌要从预防种鸡感染大肠杆菌和减少鸡胚受环境污染方面采取措施。①加强饲养管理，禽舍及用具经常进行清洁和消毒。尤其种禽必须在严格的卫生条件下饲养，预防性用药并不能代替良好的科学饲养[6]。②日常要提供全价优质饲料，并足量补充维生素和电解质，夏季注意防暑。③要注意育雏期保温及饲养密度，及时隔离病弱雏，死雏要及时检出。④一定要控制粪便污染，因为污染的种蛋很容易造成传播疾病。⑤进行免疫接种。由于禽的致病性大肠杆菌的血清型繁多，会造成疫苗保护率偏低，因此应在疫苗防制之前对当地养殖场内致病性大肠杆菌进行监测，然后选择合适的疫苗进行免疫。

大肠杆菌的特点是易形成抗药性，而且大肠杆菌可通过菌毛将其抗药性质粒传递给其他大肠杆菌，所以大肠杆菌的抗药性形成较快，环境中大肠杆菌耐药性菌株越来越多[7]。对于感染大肠杆菌的治疗，为了减少细菌耐药性的产生，应先做细菌药敏试验，再合理选择用药，既缩短治疗时间，又避免滥用抗生素，同时要注意交替用药，按疗程投药，以最大限度减少养殖户的经济损失。

[1] 姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京：中国农业出版.2002：36-39.

[2] 汪毅，刘永德，刘帅，等.鸡大肠杆菌分离鉴定与药敏试验[J].上海畜牧兽医通讯，2001（4）：19.

[3] 胡桂学.兽医微生物学实验教程[M].北京：中国农业出版社，2006：61.

[4] Gaastra W，Great F K.Host-specific Fimbrial Adhesions of Noninvasive Enterotoxigenic E.coli strains[J].Microbiological reviews，1982，46（2）：12-16.

[5] 郭振环，孔祥峰，黄小燕，等.鸡大肠杆菌病的病原菌分离鉴定和药敏试验[J].安徽农业科学，2007，35（2）：443.

[6] 孙海虹.禽大肠杆菌病的特性与防治[J].医学动物防制，2005，21（6）：460-462.

[7] 刁有祥，李久芹，陈庆普.山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2002，24（1）：21-23.