细胞因子与大脑间的联系——对目前文献的评论

姜忠良译 朱玲审校

(四川大学华西基础与法医学院药理教研室,四川 成都 610041)

细胞因子是如何调节中枢神经系统功能的?

细胞因子被发现之后,细胞因子便几乎立刻被假定为有强烈活性的神经性物质(Dinarello,1979)。早期细胞因子被认为是免疫细胞间的胞内信号传递分子(Dinarello Mier,1986),被怀疑是一种作用于免疫系统与中枢神经系统之间的重要的调节物质。萌发这种想法的一个重要的观察是：宿主的免疫活动总是伴随着其行为的改变(疾病行为,睡眠),身体温度的改变(发烧,体温降低)以及神经内分泌活动的改变。而所有这一切活动都是由中枢神经系统调节。机体感染后中枢神经系统调节的反应可推测为：增强免疫,保存能量,防止过度的炎症反应。站在综合生理学的角度发现,由免疫反应诱导产生的细胞因子通过调节中枢神经系统的功能来调节生理的、行为的、内分泌的机制来对抗感染。较早很好的证明这个综合生理观点的实例是1975年Kluger等发现蜥蜴(一种冷血动物)通过将自身移动到温暖的地方来调节其身体的温度。这种发热反应的过程显著的提升了其免疫力与细菌感染后的存活率。当时已经知道发热是由体内热源性物质诱导的,之后内热源被确定为细胞因子。

通过将多种细胞因子注射进体内或者脑室,人们得到了细胞因子神经活性的直接证据。这些研究建立起了细胞因子能够激活下丘脑-脑垂体-肾上腺轴(Berkenbosch等,1987;Besedovsky and del Rey,1987;Sapolsky等,1987),诱导发热(Duff and Durum,1983),延长慢波睡眠(Krueger等,1984),减少摄食(McCarthy等,1986)与饮水(Chance and Fishcher,1991),减少运动(Crestani等,1991)。这些影响不仅仅只在实验动物中明显出现,也同样出现在因治疗癌症而接受细胞因子注射的病人当中(Smedley等,1983;Spriggs等,1987)。在上述实验中被测试最多的细胞因子是白细胞介素-1(IL-1),尽管其他的细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)(Kapas等,1992;Kapas and Krueger,1992),干扰素(IFN)(Dinarello等,1984;Kimura等,1994),白细胞介素-6(IL-6)(LeMay等,1990),巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)(Davatelis等,1989),IL-12(Atkins等,1997)和IL-2(Riobeiro等,1993)都能诱导出一种或几种上述反应。

细胞因子的神经性功能具有重要的生理与临床意义。如细胞因子诱导的发热反应能够极大的增强T辅助细胞的活性,使细胞免疫与体液免疫两者都得到增强(Hanson,1997)。但另一方面,持续性的高热当然是有害的甚至是致命的。因此,细胞因子调节的中枢神经系统反应就可以作为临床上减少使用高剂量的细胞因子的限制性因素(Ribeiro等,1993)。也正因为如此,对细胞因子与中枢神经系统间相互作用的彻底的了解对于基础细胞因子生物学和细胞因子药物的开发都是极为重要的。

然而,研究这种相互作用是艰巨的任务。这是因为免疫系统与神经系统间的关系超级复杂,而两者在结构上又是互相分开的。目前就细胞因子在免疫系统中的产生到其在中枢神经系统中的作用这个领域中,已经进行研究的课题有：1)不同的细胞因子是如何影响中枢神经系统的?2)细胞因子信号穿越血脑屏障(BBB)的具体通路是什么?3)细胞因子是如何激活特定的神经通路以诱导中枢神经系统调节出合适的反应?尽管仔细了解文献的细节后无法对任一个上述问题给出一个简单的回答,但有点意外地细胞因子与中枢神经系统间的信号传递方式浮出水面。

影响中枢神经系统的细胞因子间的相互关系

在评价任何细胞因子对中枢神经系统的影响之前,一个需要注意到的现象是：在活体中,任何一种细胞因子水平的上升总是可能伴随着其他细胞因子水平的改变,部分是因为许多细胞因子自身就是其他细胞因子的诱导者(Olsson,1993),部分是因为一个免疫反应需要多种细胞因子(Viguier,2000)参与。大体上,多种细胞因子是依次产生与(或)同时产生以调节免疫反应的发生(炎症、抗原呈递、急性应激反应)(Choy,Panayi,2001)、发展(T细胞的激活、B细胞的激活、抗体的产生)(Callard,1989;Moriggl,1999),和终止(免疫抑制)(Standiford,2000)。在外周免疫系统中,多种细胞因子的生物活性具有交叉性,这使得它们具有功能多态性(Rubinstein,1998)。此外,某个特定的细胞因子的免疫功能可能被增强(Ostensen等,1989)或者被屏蔽(Arend等,1987),这又取决于存在的其他细胞因子。在免疫系统中发现细胞因子在生物学上相当复杂,这让人意识到决不能孤立的考虑任何一种细胞因子对中枢神经系统的影响。

一个富有启发意义的例子是：接受了高剂量的重组IL-2治疗的病人,其诱导发热过程与IL-1和TNF-α不同的是：IL-2不会刺激合成前列腺素,而前列腺素被认为是下丘脑前部的循环热源必须的下游调节因子(Coceani和Akarsu,1988)。因此,当发现高水平的 IL-2诱导IL-1和TNF-α表达的时候,人们推断出IL-2是通过IL-1与(或)TNF-α的功能间接的诱导发热过程(Mier等,1988)。但之后对于该机制进一步的研究却发现,与IL-1和TNF-α诱导的发热不同,IL-2诱导的发热不能被前列腺素合成抑制剂吲哚美辛阻断(Chapman等,1988)。当然,IL-2可能通过自身对中枢神经系统的直接作用诱导发热,也可能通过诱导表达其他的能激活发热反应的细胞因子,而这些细胞因子不依赖于前列腺素通路。最近确定了两种这类型的细胞因子：预先形成的热源蛋白(PFPF)(Zampronio等,2000)和巨噬细胞炎症蛋白-1(M IP-1)(Davatelis等,1989)。因此,IL-1和TNF-α不太可能是IL-2诱导炎症的调节因子。这在临床上是非常重要的,因为这提示重组IL-2加IL-1受体阻滞剂疗法对于降低IL-2诱导的发热很可能是无效的。站在基础科学的观点来看,这个例子揭示出中枢神经系统调节的效应由多种细胞因子参与,但是各细胞因子与中枢神经系统间的交互作用的程序却千差万别。

另一个需要注意的是：细胞因子之间的交互作用是动态而非静态的。一个关于细胞因子级联的静态观点认为：存在一个确定的细胞因子诱导链,这个链中存在一个特定的顺序(从细胞因子A到细胞因子X),一个给定的中枢神经系统效应的背后一定建立了一个这样的诱导链。使用特定的细胞因子阻滞剂与使用某种细胞因子缺陷或某种细胞因子受体缺陷(敲除)的实验动物已经检测了这个假说。研究表明向脑室中灌注IL-1ra,刺激外周免疫系统后产生的为数众多的中枢神经系统介导的反应可以极大的削弱,这些反应包括发热(Luheshi等,1997;Miller等,1997),慢波睡眠延长(Imeri等,1993),食物趋向性行为(Kent等,1996),摄食与饮水减少(Linthorst等,1995)。这些结果显示外周免疫活动可能最终会通过IL-1的中枢影响影响到中枢神经系统。然而这个推论却没有得到使用转基因动物研究的支持。比如：对于 IL-1β(Kozak等,1995)或IL-1受体敲除的动物(Leon等,1996),腹膜内注射细菌内毒素脂多糖(LPS),仅仅能稍微降低由 LPS诱导的发热。相似的是,在通过转基因技术于中枢神经系统中过度表达IL-1ra的实验动物中,注射LPS诱导的发热不能缓解(Lundkvist等,1999)。另外一方面,在IL-6敲除的动物中,低剂量LPS完全不能诱导发热(Kozak等,1998)。IL-6敲除的动物同样对IL-1诱导的发热没有反应(Chai等,1996)。因此,由这些实验结果可以看出是IL-6而非IL-1才是诱导发热的最终普遍细胞因子。由注射抑制剂与使用转基因动物这两种不同的试验方法得出的有矛盾的实验结果不应该被轻易的忽略。在生长发育全过程中大脑缺乏IL-1活性的转基因动物中,该缺陷可能被其他细胞因子与中枢神经系统间的联系补偿。例如：在LPS诱导的发热过程中,IL-6可能扮演一个更显著的角色。因此,任一个细胞因子与中枢神经系统的交互作用都可能是个动态的过程。也就是说,一种细胞因子的缺乏可能引发另一种细胞因子来替代其功能。从这个意义上讲,研究中枢神经系统对细胞因子的作用就不能只通过转基因动物来研究。通过整合细胞因子抑制剂与转基因动物实验双方面的研究发现：尽管在不同类型的感染中起决定作用的细胞因子可能不同(比如局部感染与系统性感染,细菌性感染与病毒性感染),但IL-1、IL-6、TNF-α和 INF-γ是主要的具有中枢神经系统活性的细胞因子。

细胞因子信号穿过血脑屏障(BBB)的通路

无论哪个细胞因子介导了一个给定的中枢神经系统的反应,血脑屏障总是作为一个细胞因子与中枢神经系统交互作用的屏障存在。对于细胞因子穿越血脑屏障可能依赖的通路,目前研究了5种：1)细胞因子被主动的转运通过血脑屏障;2)细胞因子激活了外周迷走神经,而被激活了的外周迷走神经转而又激活了中枢神经系统中的特定靶点;3)细胞因子在血脑屏障的室周器(CVOs)处漏出从而通过血脑屏障,并在CVOs的周边区域激活中枢神经系统的靶点;4)细胞因子诱导血脑屏障的细胞产生分泌进入大脑实质的细胞因子;5)细胞因子由渗透通过血脑屏障的白细胞携带进入中枢神经系统。

Bank的研究团队是细胞因子主动转运进入中枢神经系统的主要提倡者(Banks等,1995)。在过去的10年以致更长的时间里,他们已经提供了充足的证据以证明几种细胞因子(IL-1,TNF-α,IL-2)是被转运通过血脑屏障的(Banks等,1989,1995;Waguespack等,1994)。在这些研究中使用的方法是：经静脉注射由放射性元素标记的细胞因子,然后在脑组织中检测这些细胞因子的量。在一个实验中,他们向实验鼠注射了重组人类IL-1α(rhIL-1α)然后在实验鼠的大脑中检测了 rhIL-1α和鼠源IL-1α(mIL-1α)(Banks和 Kastin,1997)。他们发现在实验鼠的大脑中,绝大部分 IL-1α是 rhIL-1α而非 mIL-1α,并且rhIL-1α在大脑中的含量比血液中的含量要高。由此得出的推论是：在外周注射了IL-1α之后,在大脑中出现的 IL-1α主要来源是经外周转运通过血脑屏障进入大脑的IL-1α而非大脑细胞自身合成的新的IL-1α。这些实验指出在细胞因子通过血脑屏障的过程中,主动转运扮演一个非常重要的角色。但是一个警告是：被吸收进入脑组织的带有标记的细胞因子可能反映的是细胞因子与血脑屏障的结合而非细胞因子通过血脑屏障。这个问题由Maness等提出,他在实验中发现,静脉注射带有放射性标记的IL-1α之后,会在大脑实质中出现该 IL-1α,但绝大多数的放射性却集中在大脑内皮细胞(Maness等,1988)。相似的是：Hashimoto等通过使用电子显微镜发现：静脉注射用金标记的IL-1之后,在很短的时间里被标记的IL-1被发现集中在大脑内皮细胞的表面和大脑内皮细胞胞饮小泡里(Hashimoto等,1991)。

细胞因子进入中枢神经系统的第二条通路是迷走神经。有趣的是,当Pitterman等第一次为评价迷走神经的角色而切断实验动物腹部迷走神经的时候,并没有观察到任何由外周LPS诱导的反应的改变(Pitterman等,1983)。11年之后,Watkins等发现由外周LPS诱导的痛觉过敏可以通过切断迷走神经来阻断。于是他提出了外周细胞因子可以通过迷走神经的传入通路刺激大脑的特定区域,这样便建立了外周细胞因子与中枢神经系统的联系。自此,众多描述迷走神经参与的外周细胞因子与中枢神经系统交互作用的研究被发表了出来。这些反应包括了发热(Sehic和Blatteis,1996),HPA轴的激活,下丘脑去甲肾上腺素的消耗(Fleshner等,1995),慢波睡眠的延长(Opp和Toth,1998),摄食行为的减弱(Bret-Dibat等,1995)。各文献中发现的差异可能是由于LPS剂量和给予途径的差异引起的。现在已经清楚的是：对于腹膜内注射低剂量LPS诱导的信号传导,传入迷走神经的确扮演了重要的角色。换句话说,对于腹膜内注射高剂量LPS或者静脉注射LPS诱导的中枢神经系统反应,迷走神经切断后就没有作用了(Romanovsky等,1997;Konsman等,2000;Hanse等,2000,2001)。此外,位于肝脏的迷走神经分支看上去像是腹部炎症信息传导入大脑的主要神经系统(Watkins等,1994;Simons等,1998)。

对于细胞因子刺激传入迷走神经与其如何触发中枢神经系统特定区域的完整回路的解释,目前已经提出了几个假定的机制。Goehler等在靠近迷走神经末端的细胞上发现了特定的IL-1α结合位点(Goehler等,1997)。此外,腹膜下注射 LPS之后,在腹部迷走神经协助下免疫细胞会诱导IL-1β的免疫活性(Goehler等,1999),认为IL-1结合细胞与迷走神经终端构成了调控腹部炎症水平的传导器单位。然而这种类型的传导器单位是否在其他的细胞因子中存在,这依然是有待证实的。有两个研究发现：通过切断迷走神经可以阻断经由外周注射IL-1(Hansen等,1998)或者 LPS(Laye等,1995)在下丘脑中诱导表达IL-1,认为被激活的迷走神经可能会刺激中枢神经系统合成IL-1。然而需要注意的是：大多数原位杂交研究发现下丘脑中的IL-1表达只在非神经细胞中(Yabuuchi等,1993;Nakamori等,1994,Buttini and Boddeke,1995;Quan等,1998a)。因此,一个依然有待解决的困难是如何解释当迷走神经兴奋性上升的时候会刺激下丘脑中的非神经细胞产生IL-1。尽管如此,Hosoi等通过使用RT-PCR和ELISA展示了电刺激传入迷走神经确实可以在下丘脑与海马回中诱导表达IL-1(Hosoi等,2000)。

第三条通路是细胞因子可能在血脑屏障的漏洞CVOs处影响中枢神经系统。这个理论较早的一个提倡者是Clark Blatteis,他展示了通过损害器官血管终板(OVLT)这个靠近下丘脑体温调节中心的CVO可以抑制腹膜内注射 LPS诱导的发热(Blatteis等,1983,1987)。另一方面,Stitt报道发现切除OVLT后会加强发热反应(Stitt,1985)。相似的是,对另一个CVO极后区(AP)的集中研究也得出了有争议的结论。Lee等展示了通过移除AP这个靠近孤束核(NTS)的CVO,可以阻断下丘脑室旁核(PVN)中由IL-1诱导的c-fos表达(Lee等,1998)。Ericsson等却发现AP损害后 PVN中 c-fos表达没有改变(Ericsson等,1997)。这个实验结果的差异可能是由于移除范围与LPS、IL-1使用剂量的差异导致的。看上去低剂量的LPS与IL-1可能会特定的影响CVOs,高剂量的LPS与IL-1可能会通过其他的位点穿过CNS。

第四条通路是外周的免疫刺激可能会诱导BBB细胞产生细胞因子进入大脑实质。Brady等是第一个注意到在外周注射IL-1会在 BBB细胞中诱导出强烈的转录活性(Brady等,1994)。随后,在原位杂交研究中发现,BBB细胞对外周免疫刺激的反应是产生IL-1(Quan等,1998a),IL-6(Vallieres and Rivest,1997),TNF-α(Nadeau and Rivest,1999)。此外,在外周注射了高剂量的LPS之后,在整个大脑的大部分BBB细胞中启动细胞因子表达的基因 Iк Bа被立即诱导表达(Quan等,1997)。此外,在系统性免疫反应中,BBB细胞表达细胞因子可能会造成整个CNS的广泛的细胞因子活性。这与我们报道的在外周注射高剂量LPS之后会在大脑所有区域中发现IL-1生物活性这一点是相吻合的(Quan等,1994)。

认可度最低的一种通路是细胞因子可能通过渗透入大脑的白细胞进入大脑。很早就发现白细胞可能通过正常的与病理的两种途径进入大脑(Oehmichen等,1982)。在正常状态的大脑中,分散的随机的进入大脑的白细胞为CNS提供了免疫监护(Hickey,1991)。由于在正常状态下的大脑实质中没有发现白细胞表达的细胞因子,所以可以断定在正常状态下渗透进入大脑的白细胞不会表达炎症因子(Quan,1998)。在病理条件下,如细菌性脑膜炎(Frei等,1993)、脑部缺血性损伤(Gregersen等,2000)被激活的表达炎症因子的白细胞就可能进入大脑(Del M aschio等,1999)。有趣的是,ICV注射IL-1可以引起广泛的白细胞进入大脑(我们尚未发表的观察现象)。然而,IL-1对CNS的作用可能削弱BBB的功能,造成表达细胞因子的白细胞广泛的渗透进入大脑。可以设想一个可怕的循环：CNS内的细胞因子诱导能够表达细胞因子的白细胞渗透进入大脑,而这样的结果是这些白细胞在大脑内部释放的细胞因子接下来会削弱BBB的屏障作用,这会导致非常严重的神经毒性。

需要注意的是,上面提及到的通路代表的都是生理学上的假设的机制。像细胞因子这样的大分子转运通过血脑屏障的具体过程以前从来没有被描述过。在分子层面,这个假定的转运分子必须与细胞因子相结合,接着通过细胞质,或者从细胞膜的一边移动到另一边,然后释放那个完好无损的细胞因子。目前尚不知晓其他的转运系统有这样的功能。同样的,迷走神经向CNS传达免疫信号,这代表了一个假设的免疫状况被调节的传感通路。一个非常令人着迷的问题是：迷走神经向CNS传导免疫与非免疫信号的过程差异是怎样的?根据第一个实验,细胞因子经由CVOs泄露进入大脑看上去是个简单的途径。M aness等发现尽管可以在CVOs的细胞外空间中发现细胞因子,但是细胞因子很少进入大脑实质。这可能是因为环绕在CVOs周围的胶质界膜的阻挡作用造成的。然而,CVOs处的细胞因子要产生作用就必须被转入进入大脑,可能是经由细胞因子自身的运动作用,也可能是结合具有高扩散性的转运分子进入到附近的结构,或者是由CVO里的投射神经元产生的信号进入大脑(Mark and Farmer,1984)。CVO中这样的转换是如何发生的依然是个待解的问题。最后,BBB细胞产生细胞因子显示出免疫信号穿过BBB。我们给出次级感染剂量的LPS只能诱导在BBB结构中表达细胞因子,感染剂量的 LPS诱导在BBB内部细胞因子的表达(Quan等,1999a)。因此,BBB细胞广泛的表达细胞因子可能与系统免疫刺激特别相关。

这些被提及的通路不能够只被认为是相互冲突的假设。例如CVOs,已经知道它可以接受传入迷走神经(Kalia and Sullivan,1982;Shapiro and Miselis,1985)。然而,切断迷走神经可能会影响CVOs中的信号传导过程,并且对CVOs的损害可能会减弱迷走神经调节的效应。同样的,鉴于细胞因子可能会被转运穿过BBB,而细胞因子与大脑内皮细胞结合后也能够诱导表达新的细胞因子(Reyes等,1999)。因此,这些通路既可能是同时进行也可能是在不同的条件下独立的进行。细胞因子的剂量与路径能够控制通路与CNS的最后反应,如同前面所描述的那样。此外,BBB的状态可能也是个因素,特别是在炎症反应与受伤的状态。最后,细胞因子间的混合或者结合可能会导致其间的交互作用。

由细胞因子介导的特定神经回路的激活

定义一个由细胞因子调节的CNS反应中的特定神经回路是另一个可怖的挑战。由前面提到的可以看出,细胞因子可能会诱导多种CNS调节的效应是非常清楚的。然而,这些效应却是由不同的神经回路控制的。像喂食行为是由腹内侧小丘脑核(VMH)和下丘脑边缘区(LHA)(Oomura,1988)综合平衡作用的结果。另一方面,可以确定的是：发烧是有视前区(APO)神经元细胞介导的(Blatteis等,1984)。HPA轴的激活明显包括了PVN。细胞因子诱导的睡眠类型的改变在神经细胞学轨迹上的精确定位目前依然不清。对于寻找细胞因子与这些神经回路的联系的研究,目前有两种想法：第一种假设细胞因子能够到达大脑中的任何一个位置,并且在这个特定位置上细胞因子的作用决定了他们的活性。第二种假设在不同的大脑位点上会发生有序的激活,细胞因子在一些关键位点上引发链式反应从而产生远程的神经回路。

通过使用电生理学的方法我们已经检测了在大脑特定区域细胞因子直接作用于该区域的神经行为。在APO存在温度敏感神经元,这种神经会在体温升高(热敏)和降低(冷敏)的时候增强其调节速度(Boulant,1988)。这些神经细胞元看上去像是控制体温的“设定点”。通过应用微电泳技术将IL-1导入进APO发现：热感神经元的活性降低但冷感神经元活性升高(Hori等,1988)。这些结果在体外实验中得到了证实,这个实验准备了包含有APO的下丘脑切片(Shibata and Blatteis,1991)。这个由IL-1诱导的改变是和如下的观念契合的：IL-1作用于APO,并且调节其体温调定点到一个更高的水平,这时机体就开始发烧了。在另外一个系统中,Hori等展示了IL-1局部作用在VM H中的葡萄糖敏感神经元与IL-1诱导的厌食症密切相关(Hori等,1992)。因此,如果细胞因子到达了这些大脑位点,它们可以通过直接的局部作用而诱导表达与之相称的反应。

另外一点,细胞因子可能通过触发突触间的神经传递从而在一个远距离处将信号传达到靶神经结构。Adrian Dunn是第一个证实了在外周注射IL-1刺激大脑中产生去甲肾上腺素机制的人(Dunn,1988)。随后人们发现,对外周免疫系统的刺激也能导致大脑中5-HT(Dunn and Welch,1991;Mohan Kumar等,1998)和多巴胺(Dunn,1992;Song等,1999)的代谢途径的改变。这些数据揭示细胞因子可能通过去甲肾上腺素能的、多巴胺的、5-羟色胺能神经的通路影响CNS。Ericsson等的杰出工作揭示可以通过切断连接骨髓非肾上腺能神经和PVN的神经纤维来削弱注射IL-1激活PVN神经元的作用(Ericsson等,1997),最后,直接向延髓头端腹外侧(该区域含有去甲肾上腺素能神经元,这些神经元参与了PVN)直接注射前列腺素E2,这样可以模拟通过外周注射IL-1诱导激活PVN的过程(Ericsson等,1997)。综合起来考虑,可以推断出IL-1的循环可能在骨髓中诱导前列腺素的合成,而这又会刺激该区域的去甲肾上腺素能神经元激活PVN。

应该被指出的是：上诉两种细胞因子信号传递的形式相互之间是不互相排斥的。比如,在外周注射 IL-1(Komaki等,1992)和LPS(Van Dam等,1993)可以诱导PVN自身进行前列腺素的合成。这些实验准备中使用了含有PVN的下丘脑切片,实验显示IL-1和前列腺素的局部作用同样能够刺激CRF的合成(Sandi and Guaza,1995)。

另一个寻找细胞因子可能在CNS中具体哪个部位作用的方法是将细胞因子定位并(或)将他们在CNS中的受体也定位。Breder等是第一个在下丘脑神经纤维上定位IL-1β-ir的团队(Breder等,1988)。这些结果在稍后的三个其他研究中被部分的证实了。这三个研究展示了在其他的几个物种的下丘脑中发现了IL-1β-ir(Lechan等,1990;Molenaar等,1993;Huitinga等,2000)。Huitinga等进一步定义了这些饱含IL-1β的神经元为催产神经元。在这些神经元中发现的IL-1β的功能目前依然未知。这是因为对这些神经元使用目前已知的任何刺激之后进行平行的比对,却发现这种神经性的IL-1水平没有任何的变化。在原位组织杂交化学研究中,也没有在下丘脑神经元中发现IL-1β mRNA的程序性表达。另一方面,在外周的免疫系统遇到刺激之后,IL-1β最初是在神经胶质细胞与内皮细胞中诱导表达的(Van Dam等,1992,1995;Buttini and Boddeke,1995;Quan等,1998a),而不是在神经元中。相似的是,TNF-α和IL-6在大脑中所有的非神经细胞中被发现诱导表达(Vallieres and Rivest,1997;Laflamme and Rivest,1999)。因此,CNS中发现的细胞因子的首要来源可能是非神经细胞。

对于细胞因子受体,开初使用的是放射性元素标记的IL-1来研究。研究发现整个大脑广泛的结合了IL-1,并且集中于许多神经元丰富的位点如：齿状回,下丘脑和小脑的粒细胞层(Farrar等,1987)。然而,随后通过免疫组织化学与原位杂交组织化学的研究发现,在BBB(血脑屏障)细胞(Cunningham等,1992;Ericsson等,1995;Van Dam等,1996)的影响下,IL-1I型受体(IL-1R1,IL-1的受体)在大脑中的分布受到了很大的限制。带有IL-1R1的神经元细胞只在包括基底外侧杏仁核,下丘脑弓状核,三叉神经和舌下神经运动核和极后区(Ericsson等,1995)。有两个原因使得我们认为这样受限制的分布是超出预期的。第一,IL-1受体表达的基因启动子缺乏CAAT和TATA盒,并且与缺乏TATA启动子的结构性表达基因的终止脱氧核酸转移酶相似的一个显著的顺序(Ye等,1993)。因此,可能估计出的是,IL-R1被普遍性的低表达。第二,可以推测的是神经元对于IL-1的刺激敏感,例如在PVN,APO,VM H中的神经元看上去不含有IL-1R1。相似的是,TNF-α受体同样也主要在BBB细胞中被发现(Cunningham等,1997)。因此,一个原先没有预料到的推论是：在大脑的许多位点中细胞因子的局部作用可能实际上是经由内皮细胞上的受体来进行调节。我们以及其他人已经展示了外周的免疫入侵可以在整个大脑的内皮细胞中强烈的激活COX-2(COX-2是种受到限制的前列腺素合成酶)(Cao等,1996;Matsumura等,1998;Quan等,1998b)。此外,很多细胞因子诱导的CNS效应是可以被COX抑制剂阻断的(Szekely,1978;Johnson and Von Borell,1994;Dunn and Swiergiel,2000)。因此,与最初关注的BBB可能阻止细胞因子传递信号给CNS相反,BBB细胞可能提供一个细胞因子和CNS交互作用的重要界面。

关于海马回和扁桃体中的含有IL-1R1的神经元,最近的研究发现已经说明了IL-1的一种新型神经活性。即IL-1可能作用于这些神经元以阻止长期的势差现象(Katsuki等,1990;Bellinger等,1993;Cunningham等,1996)和突触能力变弱。这种新发现的细胞因子活性可能与细胞因子改变学习(Rachal Pugh等,2001)、记忆(Rachal Pugh等,2001)与情感(Pugh等,1999)的神经传导过程相关。

在神经性疾病的致病原因中细胞因子扮演什么样的角色?

细胞因子生物学上的一个主要特征是炎症细胞因子是双刃剑。在外周免疫系统中,抵抗感染与癌症需要适当的免疫反应,而炎症细胞因子则是这些适当免疫反应过程的核心。比如：IL-1R1敲除的老鼠表现为延迟型过敏反应减弱并对单核细胞增多性李司忒氏菌具有高度易感性(Labow等,1997)。同样在缺乏TNFR1的小鼠中,由CD8+T细胞介导的杀死肺癌细胞的过程受阻(Prevost-Blondel等,2000)。另一方面,通过细胞因子治疗得到的一个教训是：细胞因子不但可以引起受感染的细胞和癌细胞死亡,它同样可以引起上述细胞旁边的正常细胞的死亡(Heaton and Grimm,1993)。相似的是,细胞因子和CNS的交互作用即有生理的也有病理的作用。实际上,从临床研究及在体,离体实验中积累了越来越多的证据指出：炎症细胞因子可能在数种神经性疾病中扮演了极为重要的角色。

证明细胞因子在人类神经退行性疾病中的病理作用的临床证据

IL-1和T NF-α早已被怀疑在与炎症相关的神经细胞死亡中扮演重要的角色。一个早期的暗示这些细胞因子作为神经病理的促进因子的例子是细菌性脑脊膜炎。在这种疾病中,大脑皮层中有大量的神经细胞死亡,伴有炎症,还有脑水肿(Mito等,1993),这可导致死亡,并在活下来的患者中造成长期的神经性后遗症。这种疾病的预后已经被证实与脑脊液(CSF)中TNF-α和 IL-1的浓度相关(Mustafa等,1989;Arditi等,1990)。相反的是,在这种疾病的恢复过程中,的确观察到增高的可溶性IL-1受体水平,而这恰恰是可以抑制IL-1效应的现象(van Deuren等,1997)。此外,已经发现通过使用抗血清对抗TNF-α能够保护机体,对抗细胞内毒素的致命效应(Beutler等,1985)。因此,这些研究结果指出了IL-1和TNF-α在这种疾病的发病机理总扮演的角色。

另一个例子是多发性硬化症(MS)。这种疾病的主要损害是免疫介导的CNS损害和髓鞘的结构破坏(Brosnan and Raine,1996),尽管MS经常表现为一种拖延的,多变进程的疾病。髓鞘脱失可能造成神经纤维的退化。以下事实可以说明IL-1和TNF-α参与了这个疾病的发病机制：1)在MS患者的大脑损害中,TNF-α免疫反应性被发现与星细胞与巨噬细胞相协同(Hofman等,1989);2)高于受控制水平的IL-1和TNF-α经常在MS患者的CSF中被检测到(Hauser等,1990);3)一个临床上有效的治疗 MS的药物是干扰素β(IFN-β)(Munschauer and Stuart,1997),IFN-β的作用是抑制 IL-1和TNF-α的产生并且增强IL-1ra的产生(Coclet-Ninin等,1997)。这些证据导致了IL-1和 TNF-α是MS发病机制中的关键因素的假说(Raine,1994)。

更近的一段时间,IL-1和 TNF-α都在患有帕金森氏病病人的CSF中被发现(Mogi等,1996)。帕金森病症候出现的首要原因是终脑皮层黑质多巴胺能神经元的丢失(Hirsh and Herrero,1997)。在帕金森病病人的终脑皮层(Mogi等,1994)和黑质(Boka等,1994)中我们发现了高水平的TNF-αmRNA表达。此外,在帕金森病患者的多巴胺能神经中我们也观察到了转录因子 NF-к B的激活(Hunot等,1997)。IL-1和 TNF-α是两种被人熟知的 NF-к B激活因子(Miyamoto and Verma,1995)。这些发现指出：在被帕金森病损害的位点,IL-1和TNF-α是有活性的。另外,在一个孤立的病例报告中,一个遭受严重脑膜炎折磨的年轻女孩随后发生了帕金森样症状(Geddes等,1993),这同样指示了炎症细胞因子在帕金森病的致病机制中扮演了某个角色。或许临床上最具有广泛性的能证明炎症细胞因子与神经退行性疾病致病间关联的证据是老年性痴呆(阿尔茨海默氏病,AD)。老年性痴呆的病理改变提示该病发作表现为：出现淀粉样沉淀、神经元纤维性缠结、平野小体(Mrak等,1997)。AD患者的组织中IL-1水平升高,并且发现他们体内具有IL-1免疫反应活性(IL-1+)的小神经胶质细胞增多(Griffin等,1989)。这些IL-1+小神经胶质细胞被发现紧靠着有纤维缠结的神经元(Sheng等,1994)与淀粉样沉淀(Griffin等,1989)。同样已经知道的是,IL-1可以上调S100β和β-淀粉样前体蛋白(β-APP)(Sheng等,1996),这是两个可以导致AD发病的重要因素(Mrak等,1996a)。此外,β-APP能够刺激神经小胶质细胞产生(Araujo and Cotman,1992)。因此,IL-1的过度表达会诱导β-APP的表达增加,而这又会导致更多的IL-1的表达。这样的一个由IL-1开启的“细胞因子循环”已经被认为是一种AD发病机制中的促进因素(Sheng等,1996)。与这个观点相契合的是,在易患AD样损害疾病的病人中,他们大脑中IL-1的表达被发现增高。这些AD样损害包括：头部损伤(Griffin等,1994),衰老(M rak等,1996b),癫痫(Sheng等,1994)。由流行病学研究发现了炎症细胞因子和AD间的关联,发现使用抗炎药物可以阻抗AD的发展。现在对抗炎药物可以干扰AD进程的一个假说是,这种效应部分得益于抗炎药阻抗IL-1的效应(Breitner,1996)。在 AD的发病机制中,TNF-α同样被认为是角色之一,尽管现在对此认识的证据不如IL-1的证据那么普遍(Mattson等,1997)。

将这些综合起来看,上面提到过的例子强烈的提示：尽管几种主要的神经退行性疾病互相之间神经病理改变差别巨大,但IL-1和TNF-α却扮演了致病过程中的角色。对于那些为数众多的旨在找寻神经退行性疾病中大脑内相关物质表达的实验研究而言,IL-1和TNF-α被假定的病理学假设是这些实验研究的理论依据。

体外实验

对于IL-1和TNF-α的神经毒性作用进行的直接检查得到的是一些模棱两可的结论。Piani等(1992)进行的早期研究发现向培养的小脑神经元细胞加入IL-1和/或TNF-α并不会导致神经毒性。然而Tauber等(1992)发现TNF-α会对神经细胞NH33.1产生毒性作用。一些研究比如Chao等(1995c)发现当把IL-1和TNF-α加到培养中的人胚胎脑细胞中可以诱导表达神经毒性,但是这两种白介素中的任何一种在单独存在的情况下都是没有毒性的。但是Strijobs和Rothwel(1995)的研究显示,在培养中的鼠大脑皮层细胞中加入高浓度的IL-1会导致神经毒性,低浓度的IL-1对由谷氨酸盐(glu)介导的神经毒性有保护神经元的作用。此外,Westmoreland等(1996)的一则报道表明,是TNF-α而非IL-1对人神经元细胞系N T2N有毒性。从上述这些研究报告中得出的这些相互矛盾的研究结果可能是由于：1.神经细胞培养中的差异;2.IL-1和 TNF-α使用剂量上的差异;3.在这些体外实验中使用的不同的细胞系之间对这些白介素诱导神经毒性的不同的敏感性导致的。

在一例神经胶质毒性的研究中,Merrill(1991)报道是IL-1而非TNF-α选择性的诱导细胞毒性以起到隔离少突胶质细胞的效果。少突细胞系一类可以向神经纤维提供髓鞘的神经胶质细胞。此外,Selmaj和 Raine(1988)还有 D'Souza等(1996)发现在同时培养星型胶质细胞和神经小胶质细胞的培养基中,TNF-α可以引起髓鞘损害,同时可对少突胶质细胞产生毒性作用。Selmaj等和 D'Souza等发现同一系列的体内实验中,TNF-α可以在多种硬化症和实验条件下的过敏性脑脊髓炎(EAE Raine,1994)中有促进性的作用。Merril等尝试证实TNF-α对少突胶质细胞的毒性作用的实验的失败可能部分归咎于在准备细胞培养的过程中没有一同培养星型胶质细胞和神经小胶质细胞。

正如先前注意到的,除了几个脑区之外,IL-1和TNF的受体在大脑中主要定位于非神经元细胞。因此,在体内实验中,IL-1和TNF-α可能直接对含有这些白介素受体的神经元细胞产生毒性作用,或者,更可能的是,IL-1和TNF-α通过激活神经小胶质细胞和/或星型胶质细胞这样一个间接的途径产生神经毒性(Chao等,1996a)。与这个主张相一致的是,IL-1和TNF-α被发现在组织培养(Merrill,1991)和体内实验(Giulian等,1988;Mizuno等,1994;Lee等,1995)中可以刺激小神经胶质细胞和星型胶质细胞的增殖。被激活的神经胶质细胞被发现可以产生一系列的潜在神经毒性物质,比如喹啉酸(Schwarcz等,1983),活性氧中间物(Chao等,1995b),活性氮中间物(Chao等,1995b)和谷氨酸盐(Piani等,1991)。因此,IL-1和TNF-α在特定脑区诱导神经毒性的表现可能需要多种细胞型的存在,对这些多种效应的评估可能必须通过多种细胞自然存在的体内实验模型来进行。

体内实验

IL-1和T NF-α两者目前都已经被用于临床实验以治疗癌症。诸如头痛,思维混乱和惊厥等神经毒性作用在给予高剂量的无论是 IL-1(Redman等,1994)还是 TNF-α(Mittelman等,1992)都已有报道。然而这些毒性作用与神经病理方面的联系却尚未得到研究。

目前最令人信服的有关IL-1的神经毒性作用的证据来自急性脑损伤的动物模型。头部创伤(Taupin等,1993;Shohami等,1997),脑缺血(Minami等,1992;Wang等,1994;Saito等,1996)和中枢神经系统的毒性兴奋性损伤(Yabuuchi等,1993)会快速而显著的升高大脑内IL-1的mRNA和蛋白水平。注射IL-1β已经显示可以恶化由脑缺血引起的损害(Yamasaki等,1992;Loddick and Rothwell,1996)。与此相反的是,注射IL-1a却可以在上述脑损害模型中显著的降低神经元损害(Relton and Rothwell,1992;Garcia等,1995;Toulmond and Rothwell,1995;Loddick and Rothwell,1996)。过量表达IL-1ra可以达到同样的神经元保护性作用(Yang等,1997),敲除IL-1β转换酶(ICE,目前已知的唯一的IL-1β转换酶,该酶可以催化IL-1β从其无活性的前期形式转换为有活性的成熟形式)(Schielke等,1998),或者抑制 ICE的活性(Loddick等,1996;Hara等,1997)。所有这些效应看上去都是因为IL-1活性受到了抑制。此外,通过向大脑中注射能够中和IL-1ra的抗体可以显著的增强脑缺血造成的损害(Loddick and Rothwell,1996),说明在脑缺血的情况下机体内生的IL-1ra可以起到降低IL-1的神经毒性作用。这些发现强力的说明IL-1可以作为急性脑损伤情况下的针对神经毒性的药物。

在急性脑损伤的情况下,TNF-α表达的同时也可诱导IL-1同步表达(Wang等,1994;Saito等,1996;M athiesen等,1997;Zhai等,1997)。向外周神经注射外源的TNF-α可以诱导轴突的降解和脱髓鞘(Redford等,1995;Madigan等,1996),然而这一效应可以被 TNF拮抗药己酮可可碱阻止(Petrovich等,1997)。此外,因在实验条件下引起的自身免疫性脑脊髓炎(EAE)而导致的髓鞘脱失和突触降解可以通过阻止TNF-α的作用而好转(Selmaj等,1995)。这说明自身产生的TNF-α与注射外源性TNF-α一样具有潜在的神经毒性。最后,通过转基因技术已经得到了具有在星状胶质细胞中过量表达TNF-α的转基因小鼠(Campbell等,1997;Probert等,1997)。这些转基因小鼠表现出不同程度的神经退行性特点,从轻度的髓鞘脱失到灰质与白质的实质性破坏。这些发现说明TNF-α在体内实验中具有潜在的神经毒性。此外,TNF受体敲除的动物在神经病理学上展现出降低的特征,IL-1受体敲除的动物在鼠类EAE动物模型中表现出彻底的保护性(Schiffenbauer等,2000)。

尽管在上述引用的文献支持IL-1和TNF-α具有神经毒性作用,其他的文献却支持相反的结论。因此,从体内实验研究中可以得知IL-1或/和 TNF-α可以刺激抗氧化酶的合成(Wong and Goeddel,1988;Visner等,1992)和神经生长因子(Lindholm等,1988;Gadient等,1990)。抗氧化酶和神经生长因子这两者都已经被发现在神经损伤中扮演极为重要的神经保护性的角色(Chan等,1997;Mattson and Scheff等,1994;Wengenack等,1997)。IL-1和TNF-α也已通过体外实验证实在外源性毒性导致的神经退行性过程中具有神经保护的作用(Cheng等,1994;Strijbos and Rothwell,1995)。体内实验发现,通过小的缺血诱导的IL-1表达可以降低随后的全面性缺血导致的神经性损害(Ohtsuki等,1996)。随后的能够强力支持IL-1具有神经保护作用的报道是缺乏TNF受体的小鼠通过兴奋性毒性和脑缺血损害后,其伤害会被扩大(Bruce等,1996)。因此,在脑损伤的动物模型中,IL-1和TNF-α可能扮演非常重要的神经保护性角色。

目前对于IL-1和TNF-α在神经退行性疾病中扮演什么角色的重要问题,已经不再是这些细胞因子是起神经毒性或是保护性作用,而转成了这些细胞因子在何种条件下会起到神经保护或者神经毒性的作用的问题。现在主要考虑有三个基本的参数,第一个参数是这些细胞因子的水平。Strijbos和 Rothwell(1995)已经发现无论IL-1的水平有多么低,其在谷氨酸盐诱导的培养条件下的神经细胞系统的神经退行性模型中都起到缓解的作用。而高浓度的IL-1(1994)自身却会诱导神经毒性。相似的是,Cheng等(1994)报道了 TNF-α在10 ng◦ml-1的浓度下对于谷氨酸盐诱导的神经死亡起到保护作用。然而Chao和Hu(1994)报道 TNF-α在 20-100 ng◦ml-1浓度下却会加强谷氨酸盐的神经毒性。尽管在这两项研究中使用了不同的细胞系,但这两个相反的结果仍然可能是因为不同浓度的TNF-α的作用。

另一个重要的参数是暴露的持续时间。Scarim等(1997)的研究表明,将大鼠胰岛暴露于IL-1中18个小时可以导致胰岛细胞可逆性的损伤;暴露36个小时会对这些细胞的代谢功能产生不可逆的抑制;暴露96个小时会导致胰岛彻底的恶化。但是有关IL-1和/或TNF-α在大脑中暴露时间长短是起神经保护性作用还是神经毒性作用,目前尚未有相关的实验验证。

第三个重要的参数是作用的位点。Stroemer和 Rothwell(1997)的研究表明,在神经毒性浓度下的IL-1可在纹状体而非大脑皮层对皮层-纹状体投射神经元造成损害。因此,IL-1和TNF-α的神经毒性作用在不同的脑区其毒性作用可能是有差异的。也就是说,某些特定的神经结构对这些细胞因子是甚为脆弱的。然而,目前尚缺乏脑区、结构及细胞型对IL-1和TNF-α诱导的神经毒性的敏感性的相关调查。

慢性外周感染后引起的特定神经退行性形式

据前所述,目前已经很清楚在CNS中细胞因子不能简单的被归为朋友或者敌人。理解在CNS中细胞因子的生理性作用转换成病理性作用的过程是非常重要的。为此目的,我们选择了一个独一无二的模型来研究CNS中细胞因子的病理生理学特征。人类中感染了睡病虫这种寄生虫的患者会出现非洲昏睡病的病症,这是一种严重的包括了大脑的炎性病症。在感染了啮齿科亚种布氏布锥虫的大鼠中,这些寄生虫被发现寄居在脉络丛和脑室周围器官中(Schultzberg等,1988)。尽管这些寄生虫极少能通过血脑屏障(BBB)进入脑实质(Schultzberg等,1988),它们依然会通过刺激外周免疫细胞分泌IL-1和TNF-α(Bakhiet等,1996)。在感染布氏布锥虫的早期阶段可以观察到大量的CNS-细胞因子介导的生理反应。这包括了发热,病态行为和食欲下降。在感染的下一阶段,会出现许多神经病理学方面的症状诸如：失眠、沮丧、记忆丢失、认知障碍、幻觉、躁狂性发作和癫痫性发作(Dumas and Bouteille,1996)。将感染了布氏锥虫的大脑中细胞因子的表达和神经病理学联系起来很可能提供了一个独一无二的揭示在CNS中细胞因子何时以及怎样表达会导致非病理性的效应转化为神经毒性的效应的机会。

我们发现在感染了布氏锥虫的大鼠中细胞因子呈现持续性的表达(Quan等,1999b)。在感染22天后观察到IL-1β和TNF-α mRNA表达的升高,并且这一现象一直伴随感染的过程(在25-30天以上)。

在大脑感染的动物中除开在第56天的几个例子之外基本没有观察到特别令人不快的异常状况。仅在脑室周围的非神经细胞发现了散在的凋亡细胞。

第36天,在迷走神经的两侧,外侧嗅束和海马喙中发现了严重的神经纤维退化。散在的退化的纤维同样也在脊髓三叉神经核,薄束核内侧缘,深部小脑核和小脑下脚,侧丘脑和几个靠近侧脑室的纤维束中被发现。在这些退化的神经纤维中难以见到退化的神经元细胞伴随其中。因此,轴突和终端的退化在这个模型中是很明显的。此外,在这些大脑中我们还发现了凋亡的非神经细胞。

观察到的神经毒性效应与大脑中炎性细胞因子的长期诱导分泌紧密相关,特别是 IL-1和 TNF-α。这种广泛的,总是对称表达的这些分子表明它们应该能通过细胞外间隙分布到整个脑组织。因此,这些发现指向有关这些炎性细胞因子神经毒性的几个独特的特征：1)特定的大脑结构显现出更强的易感性;2)这种神经毒性的损伤不仅限于神经元细胞,非神经元细胞同样也表现出细胞退化;3)非神经细胞的损伤可能涉及到细胞凋亡,而神经元细胞的损伤表现出细胞毒的作用。

有趣的是,当我们对感染了布氏锥虫的大鼠用水杨酸钠(一种阿司匹林的衍生物)进行处理的时候,发现其CNS中IL-1和TNF-α的表达增强了,上述提及的神经退行性被显著的放大了,并且几个新型的神经退行性表现也被诱导出现(Quan等,2000)。

总的来讲,我们的研究显示长期的,而非一过性的炎性细胞因子在CNS的表达可能是神经毒性的。不同水平的这些细胞因子可能导致神经退化表现形式上质的不同。大脑中也可能存在特定的对CNS细胞因子极为脆弱的结构与细胞型。我们目前在使用敲除细胞因子受体的同时感染布氏锥虫的小鼠来验证这些假设。

推论

随着研究者们宣称细胞因子的确和CNS有联系,并且开始定义这种联系的特定通路,细胞因子和CNS交互作用这一领域便宣告成熟。在这样的一个过程中,产生了很多新的生理学概念,而这些新的生理学概念在描述CNS细胞因子活性的同时,也在吸纳不断发现的实验事实来充分理解这些机制。细胞因子载体是什么?外周迷走神经如何编码传入特定的免疫信号?血脑屏障中的细胞是否会产生未知的能够诱导薄壁组织细胞表达细胞因子的分子?炎症细胞因子经由何种分子机制可能引起神经胶质细胞和轴突细胞的退化?这些问题目前尚未得到解答。同时,细胞因子和CNS间未料到的联系显现为重要的通道。比如,细胞因子总是集中在血脑屏障细胞和接近脑室的结构中表达。因此,流动的CSF可能是CNS产生的细胞因子的主要的载体,并且传输量可能是细胞因子到达其靶点的重要模式(Proescholdt等,2000)。此外,大脑内皮细胞已经被发现能产生细胞因子,并且是CNS中主要的细胞因子受体承载细胞型。因此,内皮产物如前列腺素可能是连接细胞因子和CNS的重要连接因子。