果糖二磷酸钠对2型糖尿病大鼠近端肾小管功能蛋白的影响＊

刘红 李苌清 郑倩△

(1.川北医学院生理学教研室;2.川北医学院药理学教研室,四川 南充 637100)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患病率近年呈快速增长态势,肾脏功能损害是糖尿病常见并发症之一。果糖二磷酸钠(Fructose sodium diphosphate,FDP)能调节葡萄糖代谢中多种酶系的活性,改善细胞缺氧、缺血的状态,延缓细胞凋亡,临床主要用于心肌缺血、心绞痛、脑梗塞的辅助治疗[1]。然而,FDP对糖尿病患者肾脏功能是否具有保护作用,特别是对肾小管中葡萄糖唯一重吸收节段-近端肾小管(Proximal tubule,PT)管周膜上的关键功能蛋白-钠泵活性的影响与可能机制,目前尚未发现研究报道。本实验拟研究FDP对高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)复制的T2DM大鼠模型肾脏功能蛋白的保护作用,并探索其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 器材与动物

FDP注射液(山东新华制药,批号：0711079),STZ、Na2ATP、哇巴因、胶原酶(Sigma公司),血糖测定仪(三诺,长沙),SOD、NOS检测试剂盒(南京建成),[γ-32P]ATP(北京福瑞特公司),SN-6930A型液闪仪与SN-6100型γ计数器(上海核所日环光电公司)。雄性Wistar大鼠,一级,体质量(195±16)g;高能饲料(60%常规饲料,20%蔗糖,15%猪油,5%胆固醇),均由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物合格证号：SCXK(川)2004-15。

1.2 动物模型建立与分组

T2DM大鼠模型的建立参照实验室既往方法[2],4 w高能饲料喂养,空腹12 h后给予 25 mg◦kg-1的STZ一次性腹腔注射(STZ注射前用pH=4.2的柠檬酸缓冲液配成1%浓度),继续高能饲料喂养 4 w,采尾静脉血测定空腹血糖(FBG),以FBG≥7.8 mmol◦L-1作为T2DM 模型判断标准,最后选取符合条件的16只大鼠作为T2DM模型(建模成功率70%),其余淘汰。实验动物随机分为3组(n=8)：正常对照组(A);模型对照组(B);FDP治疗组(C)。治疗组参照文献用FDP 5ml◦kg-1◦d-1一次性腹腔注射治疗[3],对照组每次等量生理盐水处理,在FDP治疗期间,全部大鼠都用常规饲料喂养,自由饮水。实验动物于FDP治疗12 w末空腹12 h,1%戊巴比妥钠30 mg◦kg-1麻醉后从心脏采血制备血清标本待测,然后摘取右侧肾脏,去包膜后用滤纸吸干水分后称重,将右肾质量与体质量之比(KW/BW)作为肾脏肥大指数[4]。左侧肾脏于-70℃冻存用于近端肾小管的微分离及其管周膜上钠泵活性的测定。

1.3 生化及放免检测

血糖采用血糖仪测定,SOD和NOS的检测严格按照说明书采用751分光光度计测定。

1.4 单根PT的获取及其钠泵活性测定[5]

将显微微分离的单根PT经过低渗冻融处理后,与1μ l总ATPase测定液或Mg-ATPase测定液37℃共同孵育15min,液闪仪测定孵育液中32Pi的每分钟计数(cpm)值,利用Concet公式计算PT钠泵活性,酶的活性单位用pmol◦mm-1◦h-1表示。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 FDP对T2DM大鼠一般症状体征的影响

建立的T2DM模型大鼠与A组比较,体重明显增加,并出现腹型肥胖和多饮,多食,多尿的症状,毛发色泽晦暗,精神萎靡,活动减少,随着病程延长,除大鼠体重呈下降趋势外,其它病理症状逐渐加重,B组中1只大鼠可能由于高血糖继发酮症酸中毒而死亡;C组与B组比较,12 w后大鼠上述症状与病理体征明显改善。

2.2 FDP对T2DM大鼠生化指标和肾脏肥大指数的影响

表1可见,与A组比较,B组大鼠FBG水平与KW/BW显著升高(P＜0.01),SOD、NOS水平显著降低(P＜0.01);与 B组比较,FDP治疗12 w后,C组大鼠FBG与KW/BW显著降低(P＜0.01),SOD、NOS水平显著升高(P＜0.01)。

表1 实验大鼠血清生化指标和肾脏肥大指数的变化()

表1 实验大鼠血清生化指标和肾脏肥大指数的变化()

＊与A组比较P＜0.01,#与B组比较P＜0.01。

分组 A(8只) B(7只) C(8只)FBG(mmol◦ L-1) 5.08±0.46 13.35±3.42＊ 9.64±1.21#KW/BW(×10-3) 3.04±0.26 4.62±0.43＊ 3.65±0.32#SOD(U◦ml-1) 120.28±13.30 85.53±9.82＊ 108.68±10.47#NOS(U◦ml-1) 36.55±3.23 21.47±2.21＊ 31.54±3.12#

2.3 FDP对T2DM大鼠近端肾小管钠泵活性的影响

如表2,与A组比较,B组大鼠12 w时PT钠泵活性显著降低(P＜0.01);与 B组比较,FDP治疗12 w后,C组大鼠 PT钠泵活性显著升高(P＜0.01)。

表2 FDP对T2DM大鼠PT钠泵活性的影响()

表2 FDP对T2DM大鼠PT钠泵活性的影响()

＊与A组比较P＜0.01,#与B组比较P＜0.01。

分组 钠泵活性(pmol◦mm-1◦h-1)A(8只) 1972±154 B(7只) 1163±105＊C(8只) 1785±126#

3 讨论

糖尿病对肾脏的损害主要与持续高血糖和体内氧化增强有关,因为肾脏的微循环与肾小管长期直接处于高糖环境中,而且自身组织结构薄弱,所以容易受到损害导致肾脏功能发生改变。实验结果显示T2DM大鼠建模12 w后,血糖水平与肾脏肥大显著升高,而体内抗氧化能力的两个重要指标SOD与NOS都显著降低,一般症状与体征也明显加重。

目前研究证实FDP是细胞内糖代谢的重要中间产物,能够调节许多代谢通路,外源性的FDP通过激活磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性,使细胞内ATP浓度显著增加,促进钾离子内流,有益于缺血、缺氧状态下细胞的能量代谢和葡萄糖的利用,从而降低血糖,保护细胞的功能。T2DM大鼠经过FDP治疗12 w后,血糖水平与肾脏肥大指数显著降低,SOD与NOS显著升高,糖尿病一般症状与体征亦明显改善。有研究报道FDP能提高T2DM大鼠体内的抗氧化应急能力[6],其机制可能是通过增强细胞膜的稳定性,可以抑制局部组织及中性粒细胞在缺氧状态下氧自由基及组织胺等有害物质的释放,提高SOD活性,促进机体对氧自由基的清除,从而减轻组织的氧化损害。

目前临床上一般通过检测患者尿中微球蛋白作为诊断糖尿病肾病的重要依据,但是当尿中出现微球蛋白时,往往提示患者已进入糖尿病肾病晚期,本实验通过检测近端肾小管管周膜上钠泵的活性,观察糖尿病大鼠肾脏功能的早期损害及其FDP对肾脏功能的保护作用,发现T2DM大鼠12 w时近端肾小管钠泵活性显著降低,表明此时糖尿病大鼠肾脏功能已经受到损害,与模型对照组比较,FDP治疗组大鼠近端肾小管钠泵活性显著升高,表明FDP不仅能够抑制T2DM大鼠肾脏肥大,还能保护肾小管管周膜上的功能蛋白,这些作用可能与FDP能够降低血液粘滞度,改善局部微循环状态有关。

总之,FDP对糖尿病大鼠肾脏功能具有明显的保护作用,其机制与可能FDP降低动物体内血糖水平,改善肾脏微循环状态和提高体内抗氧化能力有关。

1 张惠荣,赵慧,赵莉莉,等.1,6二磷酸果糖治疗新生儿缺氧缺血性脑病的临床观察[J].农垦医学,2006,28(3)：182-184.

2 刘红,罗蕾,高原.2型糖尿病大鼠近球小管 Na+,K+-AT Pase活性变化[J].第三军医大学学报,2006,28(20)：2062-2064.

3 薛瑞凤,孙冬梅,郭淑香.果糖-1,6-二磷酸对糖尿病大鼠心肌凋亡相关蛋白的影响[J].现代中西医结合杂志,2010,19(7)：801-802.

4 赵焕新,高原.大鼠糖尿病早期肾脏皮质Na+,K+-AT P酶α 1-亚单位的表达[J].四川生理科学杂志,2004,26(2)：58-60.

5 高原,罗蕾,刘红.大鼠单根近端肾小管Na+-K+-ATPase活性测定方法的改进[J].生理学报,2007,59(3)：55-57.

6 李勇,施海明,奚悦文,等.果糖二磷酸钠对冠心病心绞痛的疗效及其脂质过氧化抑制作用[J].中国临床医学,2001,8(3)：252-254.