失血性休克的大鼠肠系膜动脉节律基因表达的变化＊

张惠琴 谢一舟 田国华 刘延友 汪宇辉 江舟 王正荣

(卫生部时间生物学重点实验室,四川大学华西医学中心,四川 成都 610041)

生物体内多数生理过程都存在约为24 h的周期变化,即近日节律(Circadian rhythm),近日节律是生命活动的基本现象之一[1],从简单的单细胞动物到复杂的哺乳动物均存在近日节律。在哺乳动物中,这些基因包括 Per1、Per2、Clock、Bmal1、Cry 1、Cry 2和 Tim等[2-3]。其中Per1作为近日节律振荡器的核心组件,不仅在近日节律的产生和调控中占有重要地位,还与免疫系统疾病和药物依赖及肿瘤发生息息相关[5-6]。失血性休克时生理指标如呼吸、心率和血压等重要指标的节律发生紊乱[7]。本研究以失血性休克大鼠为动物模型[8-9],初步探讨其肠系膜上动脉节律基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

雄性SD大鼠,4-6 w,体重250-300g,20只。控制饲养及实验环境条件(温度：22℃、湿度 55%、光照循环12：12),自由进食进水。

1.1.2 试剂及仪器

Trizol(Invitrogen);RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司);引物序列(上海生物工程有限公司),序列见表 1。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及模型制作

SD雄性大鼠20只,实验前禁食24 h,禁水12 h。动物随机分为休克组和空白对照组,休克组在10min内经股动脉放血使血压降至5.32 kPa(40 mmHg),并维持大鼠平均动脉压在40 mmHg 30min,造模成功。正常对照组大鼠除不通过股动脉放血致休克外,其余同休克组。

1.2.2 RT-PCR检测SMA的per1,per2mRNA的表达

实验2 h后,处死大鼠,快速分离SMA。按 Trizol法提取组织总RNA,采用半定量RT-PCR特异性扩增 per1与per2 mRNA检测其表达水平变化。所有反应均以GAPDH为内参照在同一扩增条件下进行。

表1 引物序列及扩增片段长度

逆转录反应(RT)按20 μ l体系进行逆转录反应,poly(A)mRNA 1 μ l,buffer 4 μ l,Oligo(dt)primer 1 μ l,10 Mm dNTP Mix 2 μ l,RNase inhibitor 1 μ l,RNA 1 μ l,加 灭 菌双 蒸水 到20 μ l混匀,反应条件为：65℃,5min;42℃,60min;25℃,5min。

PCR扩增per1、per2基因 PCR 反应体系为 20 μ l,取 cDNA1 μ l,加入 Taq Master Mix 9 μ l,目的基因及内参照 GAPDH 上下游引物各 1.5 μ l,灭菌双蒸水 7 μ l。扩增反应条件为：94℃预变性2min后按照94℃30 s;53℃30 s;72℃30 s共35个循环,反应结束后72℃延伸10min。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 RT-PCR产物电泳鉴定

琼脂糖电泳鉴定大鼠失血性休克后SMA的per1、per2基因表达水平,RT-PCR产物电泳结果见图1。用凝胶分析方法可看出休克组per1、per2比对照组per1、per2的条带均明显变淡。

2.2 SMA节律基因per1、per2RT-PCR产物的定量检测

通过对休克组和对照组的per1的mRNA量的比对,可看出：与对照组相比,休克组明显减低(如图2),方差分析显示差异有统计学意义(p=0.000)。通过对休克组和对照组的per2的mRNA量的比对,可看出：与对照组相比,休克组明显减低(如图2.2),方差分析显示差异有统计学意义(p=0.004)。

图1 休克组和对照组的RT-PCR产物电泳图

图2 SMA节律基因 per1、per2的定量检测

3 讨论

在失血性休克病理条件下per1、per2基因表达变化规律,国内外文献尚缺乏相关报道。从基因水平探讨节律基因在失血性休克的变化规律,将促进节律基因功能与失血性休克防治研究进一步深入。为此,本研究采用大鼠失血性休克动物模型,利用RT-PCR技术对肠系膜上动脉 per1、per2基因转录水平变化进行了探讨。结果显示大鼠失血性休克后per1、per2均显著低于正常对照组,表明在失血性休克大鼠中节律基因表达发生明显改变。推测 per1、per2节律基因表达明显降低后,引起一系列重要器官的节律功能紊乱,加剧了失血性休克的发生发展过程,其具体机制有待进一步研究。

1 刘延友,王正荣.生物节律系统的研究进展[J].西部医学,2007,19(2)：161-162.

2 Young MW,Kay SA.Time zones：a comparative genetics of circadian clocks[J].Nat Rev Genet,2001,2(9)：702-715.

3 Etchegaray JP,Lee C,Wade PA,et al.Rhy thmic histone acetylation underlies transcription in the mammalian circadian clock[J].Nature,2003,421(2)：177-182.

4 Boivin DB,James FO,Wu A,et al.Circadian clock genes oscillate in human peripheral blood mononuclear cells[J].Blood,2003,102(12)：4143-4145.

5 王跃锜,周薇,刘延友,等.节律基因Period1对吗啡依赖效应的影响[J].航天医学与医学工程,2004,17(5)：383-385.

6 Murga Penas EM,Cools J,Algenstaedt P,et al.A novel cryptic translocation t(12;17)(p13;p12-p13)in a secondary acute myeloid leukemia results in a fusion of the ETV6 gene and the antisense strand of the PER1 gene[J].Genes Chromosomes Cancer,2003,37(1)：79-83.

7 陈主初主编.病理生理学[M].北京：人民卫生出版社,2001,263-295.

8 Li YC,Okuda C,Mixobe T,et al.Measurements of glucose and lactate with microdialysis probes in blood,liver and muscle of the rat during henrorrhagic shock[J].J Kyoto Pref Univ Med,1989,98(9)：931-939.

9 陈锐,刘友生,王水明.失血性休克大鼠心肌和肠上皮细胞ND1 ND2 mtTFA基因表达的变化[J].第三军医大学学报,2004,26(16)：1432-1435.