植物多糖中糖醛酸和中性糖分析检测方法的研究进展

陈 辉 和娴娴 李浩然

（河北科技大学，石家庄 050018）

植物多糖中糖醛酸和中性糖分析检测方法的研究进展

陈 辉*和娴娴**李浩然

（河北科技大学，石家庄 050018）

综述植物多糖组分中糖醛酸和中性糖定性及定量的各种分析检测方法，并进行分类比较。

糖醛酸；中性糖；检测方法；研究进展

随着生物技术的发展，多糖组分检测方法的研究日益受到重视。多糖是由10个以上的单糖，并通过糖苷键聚合而成的一种生物大分子，其相对分子质量为数万甚至数百万。多糖一般分为均多糖和杂多糖，在天然多糖类中以杂多糖为主。在多糖组分结构中除单糖外，还含有糖醛酸、去氧糖、氨基糖、糖醇等基团。按照化学性质，植物多糖可以分为中性多糖和酸性多糖。其中后者引入了糖醛酸等基团而有酸性和一些相应的药效，通常有葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸。定量测定时，其中的糖醛酸与中性糖两种组分会相互干扰而影响到实验准确性。由于植物多糖中组分性质的不同，使组分的分析条件不同，增加了其分析测定的难度。

1 紫外分光光度法

分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。按照显色剂的不同，检测糖醛酸的方法可以分为间羟基联苯法和硫酸-咔唑法两种。两种具体方法的检测步骤类似，均是加入四硼酸钠硫酸溶液后，置于冰水浴中预冷。然后分别取空白溶液（蒸馏水）和不同浓度的标准品各l mL加入到试管里，之后轻轻的震荡，直至充分混匀，期间不断用冰水浴冷却，并将试管置沸水中加热数分钟，冷却至室温。最终加入显色试剂，摇匀，并沸水中再加热若干分钟后，冷却至室温，在指定处测定吸光度，以吸光度对浓度作图即可得出标准曲线。以上两种方法的主要区别在于显色试剂的种类和用量，分别加入的间羟基联苯的氢氧化钠溶液和咔唑的乙醇溶液，具体的显色剂用量和衍生处理时间则是依照实验过程而定。马云翔等采用3，5-二甲方酚为显色剂、参比波长为400 nm和测定波长为450 nm的测定方法，测定了不同豆类中非淀粉多糖中糖醛酸的含量，并且消除了中性单糖和木质素等干扰，使糖醛酸测定的准确度大大的提高。王远红等运用硫酸-咔唑法测定梅花参多糖中糖醛酸的含量，结果精密度比较良好，并且硫酸-间羟联苯法特异性更强。用以上两种方法分析糖醛酸时，中性单糖也会产生一定的紫外吸收，会影响到糖醛酸的定量检测的准确性。

硫酸-咔唑法随着杂质性糖浓度的增大其吸收度也增大，说明中性糖与咔唑也发生反应，因而这种方法检测的糖醛酸含量测定结果偏离理论值较大；而在间羟基联苯法中各浓度的中性糖溶液与间羟基联苯并无交叉颜色反应，故受杂质中性糖的影响较小，检测结果就比较接近理论值，此种方法测定糖醛酸的特异性较强。

2 红外光谱法

红外光谱法又称红外分光光度分析法，简称“IR”，是分子吸收光谱的一种。其利用物质对红外光区的电磁辐射的选择性吸收来进行结构分析，是各种对红外光有吸收的化合物的定性和定量分析方法。被测物质的分子在红外线照射下，只吸收与其分子振动、转动频率相一致的红外光谱。在化合物分子中存在着许多原子团，各个原子团被激发后，均会产生特征振动，其振动频率反映在红外吸收光谱上。在红外吸收光谱中，多糖的特征峰一般是3 500 cm-1处的羟基伸缩吸收峰和2 930 cm-1处的C-H伸缩振动吸收峰，而含有糖醛酸的样品大多在1 700 cm-1～1 750 cm-1范围内会产生吸收，因此特征吸收峰可以作为验证是否存在糖醛酸的定性依据，但是如果多糖中糖醛酸残基含量比较少，那么特征吸收峰就有可能会被掩盖，不能定性。在实验室中，这种方法用于验证多糖高级结构中糖醛酸的存在性。

3 色谱分析法

在植物多糖中，与糖醛酸相邻的糖单位间的糖苷键很难酸解，并且糖醛酸被释放出来后容易发生内酯化，所以对糖醛酸的分析检测比较困难。常见的糖醛酸的检测方法包括纸层析色谱法、薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法，其中以液相色谱法的运用较多。

3.1 纸层析色谱法

植物多糖组成分析中，纸色谱法属于传统方法之一。纸层析色谱法：取含量约30 μg～40 μg的单糖混合物样品溶于水中，配成质量浓度1%的溶液，并用微量吸管点样2 μL～5 μL，以葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸为参比，采用合适的展开剂和特异显色剂显色，与已知糖的斑点颜色及Rf值进行比对。其中硝酸银、联苯胺、苯胺-邻苯二甲酸等都可以用于糖醛酸的显色。如果色谱中葡萄糖醛酸有时出现两个斑点，那么其中一个是由其内酯存在引起的。张惟杰运用纸色谱法对糖醛酸进行过初步的定性分析。

3.2 薄层色谱法

在糖醛酸分析原理上，薄层色谱法和纸层色谱法基本相同。方一泓等将水解浓缩的糖样品用GF254板进行层析，以正丁醇-吡啶-冰醋酸-水（体积比为6∶4∶1∶3） 为展开剂，苯胺-丙二溶液为显色剂，分离的目标组分中乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸三者的相对Rf值之比为1.0∶2.56∶0.69。这种方法能判定糖醛酸，而且适用于对多糖组分的初步分离确认，有操作简单和成本低的特点。

3.3 气相色谱法

采用气相色谱法分析多糖的组分时，由于糖类物质结构中含有极性基团，并且极性基团的内氢键作用使分子内部的吸引力增强，会导致样品难以气化，要先将单糖制成相应的低沸点衍生物，一般采用糖腈乙酸酯衍生化法。李波等利用碳化二亚胺和硼氢化钠还原多糖样品中的糖醛酸为其相应的中性单糖，最后通过GC分析前后中性单糖含量的变化推算出糖醛酸的组成。吴昌贤等先将样品中的糖醛酸内酯转化为糖醛酸，用阴离子交换树脂将糖醛酸的还原产物糖醇酸与糖的还原产物糖醇分开，将糖醇酸内酯化后再进行三甲基硅醚衍生化，最后用GC分析。Nishide将糖醛酸内酯转化成糖醛酸后，直接用离子交换树脂将糖醛酸与中性糖分离，并进行三甲基硅醚衍生化后再用GC分析。

GC的应用可以准确定量多糖组分中各种中性单糖，但是糖醛酸需经还原后再衍生化，才能用此法检测，使操作烦琐和误差较大。

3.4 液相色谱法

液相色谱法的衍生试剂检测法和不加衍生试剂检测法。其中较多的衍生试剂检测法是PMP（即：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生法，由于生成的葡萄糖醛酸在水中并不稳定，会生成葡萄糖醛酸内酯并与之产生平衡，该方法采用碱性条件下加入PMP衍生，衍生后产生的衍生物能够产生强紫外吸收，可以用紫外检测仪检测。但是这种方法针对性强，柱前的衍生化处理也会给定量分析带来一定程度的误差。高效液相色谱法检测糖醛酸时常用到不加衍生试剂检测的方法，即将葡萄糖醛酸样品稀释到一定程度后，选择适当的色谱柱和流动相将样品中各组分分离，再用紫外或示差折光检测仪直接检测分析。Strydomn用不加衍生试剂检测的方法分析酸性、碱性和中性醛糖，成功分离15种单糖。饶金华等采用反向HPLC，在250 nm波长处进行紫外检测，测定出淫羊藿多糖由6种单糖组成，这些单糖组分实现了良好的分离，并具有良好的峰形。徐瑾等比较梯度和等度洗脱模式分析得到5种单糖获得相似的分离效果。由此得出液相色谱方法的优点在于简单快捷、针对性好以及准确性高。

4 高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法（HPCE）是一种在高压电场中，根据带电粒子的迁移速率不同而进行分离的新技术，但由于糖类物质不带电，并且无荧光基团或紫外吸收，故需先使糖带电并具特征基团，分离测定才能进行。目前大多数植物多糖的单糖组分研究采用这种方法。赵燕等用硫酸液将多糖样品水解成单糖，用PMP衍生化后对南瓜多糖进行了单糖组成测定和质量控制，流动相缓冲液选择硼砂水溶液（150 mmol/L，pH10.8）；应用CZE成功测定了唐古特大黄多糖中6种中性糖和2种糖醛酸（葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸） 组分。该法具有快速、简单、进样量小、异构峰少等优点，还可用于分析其他多糖类药物。

5 结 论

目前在实验室检测中，常用于多糖结构中糖醛酸的初步鉴定的是纸色谱法和薄层色谱法，这两种方法操作快捷且成本低。一般采用硫酸-咔唑法和硫酸-间羟联苯法这两种经典的方法，以葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸的含量来计算，能很容易测定糖醛酸的总量，但是测定值并不能反映样品中不同糖醛酸实际的含量。气相色谱法虽然所用样品量少和分辨率高，但需对糖和糖醇进行衍生化处理，会导致实验操作相对烦琐以及测定时影响因素较多，造成相对较差的重现性。采用HPLC分析糖类物质时不存在挥发性限制的问题，并且其多种分离模式可满足大多不同性质糖的分离分析，综合来看已经成为目前糖类物质分析的最主要方法。在实验室条件下，采用液相色谱法可用紫外检测器和C18柱分离分析多糖中单糖的组成，对色谱柱的特异性要求同时也降低了，因此更具普遍性和适用性。液相色谱法与质谱联用（HPLC-MS）可以对多糖组分进行准确定量定性，从而减小了检测器的非选择特征造成的误差，具有非常广阔的应用前景。

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Research progress on analytical method for uronic acid and neutral sugar in plant polysaccharidesand

CHENhui*HE xian-xian**LI hao-ran
（Hebei universityofscience and technology，Shijiazhuang 050018，China）

This paper reviews various of analytical methods for uronic acid and neutral sugar in plant polysaccharides，and the classification comparison was conducted.

uronic acid；neutral sugar；analytical method；research progress

TS236.2

A

1673-6004（2011）02-0050-04

* 陈辉，男，1985年出生，1982年毕业于河北大学微生物与生化专业，学士，教授。

** 和娴娴，通讯作者，Email：hexian 1988123@126.com

2011-03-08